Test Rosa de Bengala

De Viquipèdia
Dreceres ràpides: navegació, cerca

El test Rosa de Bengala és una prova utilitzada per a diagnosticar diverses malalties. Rep el seu nom del colorant Rosa Bengala per la característica tonalitat que adquireixen els resultats gràcies a aquest.

Molècula del Rosa de Bengala: 4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetraiodofluoresceina

El Rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetraiodofluoresceina) va ser preparat per primera vegada l'any 1884 per Gnehm, com a tint de llana que combinava halògens amb fluoresceïna i 4 àtoms de iode. El primer informe d'ús clínic data de l'any 1914, Römer va afegir Rosa de Bengala a Safranina Victòria groga per tractar la infecció pneumocòccica ocular. 

Imatge d'un Spinoloricus tenyit amb Rosa de Bengala (microscopi òptic)

Immunologia (serologia)[modifica | modifica el codi]

Diagnòstic de la brucel·losi (principalment bovina)[modifica | modifica el codi]

La prova Rosa de Bengala s'utilitza molt en el diagnòstic de la brucel·losi (o més coneguda com a febre de Malta per als humans) per la seva rapidesa, senzillesa i eficàcia, tot i que els seus resultats han de ser confirmats amb altres proves bacteriològiques i serològiques, ja que és un test molt específic però no prou sensible. Aquests dos factors el converteixen en una bona prova screening però amb inconvenients. Va ser recomanada per la FAO/OMS (1986) per al Comitè Mixt d'Experts en Brucel·losi.

Aquest test en el diagnòstic de brucel·losi, és una prova senzilla de ràpida aglutinació puntual en porta. És una prova fonamentalment qualitativa, ja que a partir de la barreja del sèrum reactiu humà o animal, és capaç de detectar la presència o absència d'anticossos contra brucella. Aquesta prova d'aglutinació permet un diagnòstic immediat, en ella normalment s'utilitza com a antigen una suspensió bacteriana, de cèl·lules mortes de B. abortus biotipus 1 (cepa S99 o S1119-3), a la que se li afegeix el colorant Rosa de Bengala, i a aquest se l'enfronta al sèrum problema sense diluir del possible afectat.

La B. abortus afecta majoritariament a bestiar boví, tot i que també pot afectar a l'ésser humà, la biovarietat 1 és la més maligna per a aquest, seguida de la 3 i la 6. Però és B. melitensis la considerada com a més patògena per a l'home.

Producció d'antigen i procediment de la prova[modifica | modifica el codi]

Segons el manual de brucel·losi bovina de l'OIE,[1] l'antigen es prepara recollint per centrifugació a 23000 g (unitat d'acceleració de la gravetat) durant 10 minuts a 4 °C les cèl·lules mortes de B. abortus i resuspenent-les uniformement en una solució fenicada a proporció d'1 g per cada 22,5 ml. A aquesta suspensió se li afegeix el Rosa de Bengala (per cada 35 ml de suspensió 1 ml de Rosa de Bengala a l'1 % en aigua destil·lada) i s'agita la barreja durant 2 hores a temperatura ambient. Aquesta es filtra per llana de cotó i se centrifuga a 10000 g (unitat d'acceleració de la gravetat) per dipositar les cèl·lules tenyides, que a continuació es resuspendran a raó d'1 g de cèl·lules per cada 7 ml de diluent (21,1 g d'hidròxid sòdic dissolts en 353 ml de solució salina amb fenol més 95 ml d'àcid làctic, que s'ajusta a 1056 ml amb solución salina fenicada). La suspensió es filtrarà per llana un cop més i dues vegades a través d'un prefiltre de fibra de vidre. El color de la suspensió ha de ser vermell intens i el sobrenedant d'una mostra centrifugada no ha de tenir colorant. El resultat final serà una solució tamponada el pH de la qual serà 3,65 +/- 0,05, per al seu millor rendiment. Aquest es guarda a 4 °C en la foscor. Per a dur a terme el test es diposita una gota del "colorant preparat" (antigen) i una de sèrum en un portaobjectes, tot dut a temperatura ambient. El portaobjectes s'ha d'inclinar repetitivament en totes direccions per així aconseguir barrejar les gotes, el procediment durarà uns minuts. En finalitzar la prova, si l'individu està infectat els seus anticossos IgG o IgM amb aglutinines específiques presents en el sèrum reaccionaran enfront de l'antigen homòleg (aglutinogen) i formaran aglutinacions. Si en reaccionar a simple vista s'observen petits grumolls com grans de sorra o un gruixut anell en la perifèria de la gota, la reacció serà positiva i per tant l'individu probablement estarà malalt (falsos positius per infeccions anteriors, gran problema en àrees endèmiques). Si no s'observa cap d'aquests canvis, la mostra segurament serà negativa (no té una especificitat del 100%). La capacitat de reaccionar amb anticossos IgG o IgM és molt útil per al diagnòstic d'individus en fase crònica de la malaltia, ja que aquests presenten un alt nivell d'anticossos IgG difícilment detectables pel tradicional mètode d'aglutinació en tub (Wright). També és el cas de les infeccions subclíniques.

La reacció de la prova enfront dels sèrums positius (presència de grumolls o anell) és deguda al fet que la unió antigen-anticòs és insoluble i tendeix a precipitar. La precipitació té lloc quan la proporció antigen/anticòs és suficient (però no sobrepassa el límit) i quan els anticossos bivalents són capaços d'aglomerar l'antigen insoluble fins al punt de formar aglutinacions visibles, gràcies a aglutinines específiques. Si la proporció antigen/anticòs sobrepassa un cert nivell, la capacitat de l'anticòs per aglomerar l'antigen disminueix i l'eficiència del test comença a decaure (augmenten els falsos negatius).

L'obtenció del sèrum problema, es farà seguint el procediment normal, permetent la coagulació de la sang i eliminant el coàgul d'aquesta.

Inconvenients[modifica | modifica el codi]

Però tot i això el test presenta inconvenients, ja que com qualsevol prova serològica aïllada no és adequada per totes i cada una de les situacions epidemiològiques, i és que no té el mateix valor diagnòstic si es realitza en una àrea endèmica o no. En una àrea endèmica la prova tindrà un valor predictiu positiu relativament baix, ja que en ella existeix un elevat percentatge d'individus sans que presenten els anticossos enfront de Brucella per haver-la sofert amb anterioritat, per tant seran falsos positius. En aquest cas, el test tindrà baixa especificitat, i és que aquest no ens permet quantificar la quantitat d'anticossos, sinó simplement la seva presència, per tant no ens permet distingir entre una positivitat deguda a la malaltia actual o un estat immunitari per infecció passada amb anterioritat.[2] Això ens obliga a utilitzar proves quantitatives per a verificar els resultats, com ara la seroaglutinació en tub la qual ens aporta una major aproximació de la quantitat d'anticossos. En una zona no endèmica el test tindrà un elevat valor predictiu positiu, cosa que permet que un resultat positiu sigui pràcticament diagnosticat, mentre que la probabilitat que apareguin falsos negatius i s'exclogui la malaltia augmenta. En aquestes zones l'especificitat del test serà elevada i la sensibilitat més baixa, en contra al que passaria en una àrea endèmica.

Oftalmologia[modifica | modifica el codi]

Diagnòstic de la síndrome de l'ull sec[modifica | modifica el codi]

El colorant Rosa de Bengala tenyeix de vermell les cèl·lules epitelials corneals mortes, necròtiques, desvitalitzades i el mucus. Permetent gràcies a un patró característic de tinció la confirmació del diagnòstic de la queratoconjuntivitis seca o síndrome de l'ull sec, on la deficiència de la pel·lícula lacrimal precorneal promou la necrosis i la descamació de l'epiteli corneal i conjuntival, i la retenció de moc en el sac conjuntival. També tenyeix els filaments i les plaques corneals i permet observar les zones amb absència de mucina, signe característic de les cèl·lules no sanes. Les cèl·lules sanes no capten el colorant, ja que algunes substàncies lacrimals el bloquegen, com ara la mucina, l'albúmina, la lisozima i la lactoferrina. En les zones on la pel·lícula lacrimal no estigui íntegra o hi hagi una disfunció en la producció dels seus components, el colorant Rosa de Bengala podrà penetrar la superfície ocular, on tenyirà principalment els nuclis cel·lulars i en menor grau altres orgànuls.[3] Aquest mateix test es pot utilitzar també per a verificar el diagnòstic del Síndrome de Sjögren (tenir els ulls secs és un dels seus símptomes).

Procediment de la prova[modifica | modifica el codi]

El Rosa de Bengala en el diagnòstic de l'ull sec, es presenta en forma de gotes oftàlmiques que s'apliquen soles directament a l'ull. Les gotes poden ser d'entre 1 i 5 μL.[4] El colorant deixarà una taca de forma temporal en les cèl·lules de l'ull que estiguin cobertes inadequadament per la pel·lícula lacrimal.

Inconvenients[modifica | modifica el codi]

Per tot això comentat, la prova resulta molt útil per a mesurar la integritat de la pel·lícula lacrimal, ja que quan aquesta disminueix permet la tinció de les cèl·lules epitelials, com també una lesió epitelial que modifiqui la capacitat d'interacció amb la capa de mucosa. Però el Rosa de Bengala tenyeix tant cèl·lules mortes i desvitalitzadas com cèl·lules sanes, i a més té una toxicitat intrínseca que indueix a la pèrdua immediata de vitalitat de les cèl·lules que no eren correctament protegides per la pel·lícula lacrimal. Aquesta toxicitat pot complicar els diagnòstics d'altres malalties que depenen de l'obtenció de cultius de virus o bacteris que es troben en la superfície ocular, que es veuran afectats per la toxicitat.[4] També és irritant i pot induir a falsos positius, i això disminueix l'especificitat del test.

Medicina (hepàtica)[modifica | modifica el codi]

Història de l'exploració de la Funció Hepàtica[modifica | modifica el codi]

La capacitat del fetge per excretar colorants va ser demostrada a mitjans del segle passat, de la mà d'Abel i Rowtree el 1909, els quals van valorar la capacitat funcional del fetge mesurant la seva habilitat per eliminar de la sang un colorant injectat via endovenosa a través de la via biliar. Aquests van mesurar l'excreció final del colorant i van concloure que l'eliminació en femtes era inversament proporcional al grau d'afectació hepàtica.

Gràcies a Rosenthal i White, aquest sistema de medició va ser substituït per la determinació colorimètrica de la quantitat de colorant residual en sang. Aquests van estudiar la desaparició d'una sèrie de colorants halogenats de la fenoftaleïna, demostrant l'existència d'un espai extravascular en el qual desapareixien els colorants abans de passar al fetge i d'aquí al sistema biliar. Rosenthal va proposar la utilització de la bromosulftaleïna com el colorant d'elecció, mentre que poc temps després Delprat i altres, van demostrar que el Rosa de Bengala era igualment eficaç per a l'estudi de la funcionalitat hepàtica.

L'ús del Rosa de Bengala marcat amb iode 131[modifica | modifica el codi]

L'estudi de la funció hepàtica amb Rosa de Bengala, sal sòdica d'un derivat halogenat de la fluoresceïna, la tetra-iodo-tetra-cloro-fluoresceïna di-sòdica, data de l'any 1923. L'any 1923 Delprat va realitzar estudis en gossos, en els que va injectar Rosa de Bengala i va efectuar extraccions seriades de sang al minut, i als 2, 4 i 16 min. Comparant el color del plasma separat de la sang extreta amb una solució testimoni, concentració de la qual es coneixia prèviament, es va utilitzar cloroform, un tòxic hepatocel·lular, que provocava un augment en la retenció en sang del Rosa de Bengala. Aquest estudi va demostrar que la depuració plasmàtica del colorant en estudi estava íntimament lligada a la capacitat funcional de l'hepatòcit.

Anys més tard, el 1927, Kerr i els seus col·laboradors van utilitzar aquesta prova a l'home, determinant el percentatge de retenció per comparació en un fotocolorímetre i en el qual s'eliminava el molest pas de la preparació d'un testimoni determinat. En l'estudi efectuat en diverses hepatopaties, va mostrar retencions majors que les observades en persones amb una funció hepàtica normal. D'altra banda, la prova realitzada en malalts amb patologia extra hepàtica, no va revelar alteracions en els seus resultats. El metabolisme del Rosa de Bengala no era suficientment conegut i es creia que al ser incorporat al torrent sanguini era extret de la sang per les cèl·lules de Kupffer i eliminat per l'hepatòcit, per les vies biliars, a l'intestí, sent la depuració plasmàtica extrahepàtica, menyspreable. No obstant això, les dosis utilitzades de 5 mg per kg de pes produïen toxicitat i el colorant retingut en l'organisme produïa fenòmens de fotosensibilitat i una determinació enutjosa al plasma ictèric.

L'any 1949, Mendeloff va utilitzar la propietat de fluorescència del Rosa de Bengala amb llum ultravioleta, demostrant amb l'estudi microscòpic del fetge de rates, que la fluorescència vermell-taronja del Rosa de Bengala apareixia únicament en els hepatòcits, amb la qual cosa va demostrar la no intervenció de les cèl·lules de Kupffer en el metabolisme de la substància en estudi. Però els inconvenients derivats de la seva toxicitat i de dificultat en la seva determinació persistien.

L'any 1955, Taplin va introduir un important avanç en la utilització del Rosa de Bengala quan es van substituir els àtoms de iode natural per un isòtop radioactiu, el iode 131. D'aquesta forma el compost marcat podia ser detectat externament mitjançant aparells adequats, amb el que s'eliminava un factor important d'error, la determinació colorimètrica en pacients ictèrics i d'altra banda desapareixia la toxicitat en funció de la mínima quantitat de Rosa de Bengala utilitzat. Tot i així, el mètode era únicament qualitatiu i amb error en factors com la dosi injectada, la mida de la persona, el volum del fetge, etc.

L'any 1956, Lowestein, utilitzant la mateixa tècnica de Taplin, va idear un mètode de valoració quantitatiu determinant el temps mitjà de captació, temps amb un lapse en el qual la radiactivitat en sang perifèrica dequeia a la meitat, el temps mig d'excreció, temps amb un lapse en qual es desfeia de la meitat de la radioactivitat captada i per últim determinava la capacitat vascular hepàtica.

L'any 1958, Nordyke i Blahd van estudiar l'excreció del Rosa de Bengala, determinant el temps d'arribada a l'intestí de la radioactivitat eliminada pel fetge, mitjançant un detector ubicat sobre la fossa ilíaca esquerre, en el que es va concloure que el temps que transcorre en arribar el colorant a la zona de localitzador, serviria per fer el diagnòstic diferencial entre lesió hepatocel·lular i obstrucció de les vies biliars intra o extrahepàtiques.

L'any 1959, els anteriors autors van considerar que la mesura de la radioactivitat sobre la zona hepàtica podria estar exposada a error per mobilitat respiratòria del fetge o gran vascularització del mateix, amb la qual cosa part de l'activitat detectada es deu a la que hi ha en la sang circulant i proximitat de la vesícula biliar, on es concentra el colorant. Així van detectar la caiguda de la radioactivitat en la sang perifèrica, mitjançant localització sobre la regió tèmporo-parietal, ricament irrigada, expressant els resultats obtinguts en termes de la relació 20 minuts/5 minuts, amb un quocient que indica el percentatge de colorant retingut en sang.

L'any 1960, Meurman va demostrar que el Rosa de Bengala circula en la sang unit en quasi la seva totalitat a la fracció albúmina de les proteïnes plasmàtiques i la resta en les globulines, sent la quantitat determinada en els elements cel·lulars sanguinis, menyspreables. Depuració plasmàtica del Rosa de Bengala Està condicionada quasi amb exclusivitat a la capacitat funcional de l'hepatòcit, en presència d'un flux sanguini hepàtic normal i permeabilitat de les vies biliars intra i extrahepàtiques.

Valor del Rosa de Bengala com a test funcional hepàtic[modifica | modifica el codi]

En la determinació de l'eliminació urinària del rosa de bengala radiactiu en 24 hores introduït en la circulació, el fetge depura quasi totalment a la sang del Rosa de Bengala marcat, tenint el ronyó un paper secundari a la seva excreció. En canvi, malalts amb alteració funcional de l'hepatòcit, el ronyó, en rebre més oferta, augmenta l'excreció de la substància radioactiva actuant com mecanisme compensador. L'estudi de l'excreció urinària del Rosa de Bengala I131 constitueix un mètode d'exploració funcional del fetge, sensible, específic, simple i innocu. La seva reacció seriada permet objectivar el curs evolutiu de les hepatopaties. Els seus resultats poden ser únicament falsejats en cas de mala suficiència renal.

Altres usos[modifica | modifica el codi]

  • En microbiologia (micologia) el Rosa de Bengala també s'utilitza com a medi DRBC (Dichloran Rose_Bengal Chloramphenicol Agar). És un medi selectiu per llevats i fongs associats al deteriorament dels aliments.[5]
  • El PV-10 [6] és una “droga” derivada del Rosa de Bengala que s'usa per tractar el cáncer de pell (melanoma). És una solució injectable al deu per cent de rosa de bengala disòdic, un derivat de fluoresceïna iodat, amb elevada activitat antineoplàsica i radiosensibilitzadora. Quan s'injecta en el teixit tumoral, el PV-10 es dirigeix específicament i es concentra en les cèl·lules tumorals, produint oxigen citotòxic quan s'exposa a la radiació ionitzant. A més, el PV-10 pot estimular una resposta immune anti-tumoral.

Referències[modifica | modifica el codi]

  1. «(Sección 2.3.) Enfermedades de los bóvidos de la lista B, (Capítulo 2.3.1.) Brucelosis bovina (Manual Brucelosis bovina, OIE)» (en castellà) p. 8. [Consulta: 13 de gener de 2014].
  2. «Rose Bengal test: diagnostic yield and use for the rapid diagnosis of human brucellosis in emergency departments in endemic areas» (en anglès). Clinical Microbiology and Infection, 11, 3, 25 de gener de 2005 [Consulta: 17 de gener de 2014].
  3. «The Dye-namics of Dry-Eye Diagnosis». Review of Ophthalmology, 15 de novembre de 2005 [Consulta: 17 de gener de 2014].
  4. 4,0 4,1 «The challenge of dry eye diagnosis». Clinical Ophthalmology, 2, març de 2008, pàg. 31-55 [Consulta: 17 de gener de 2014].
  5. «DRBC Agar Base» (en anglès). Oxoid Limited. [Consulta: 20 de gener de 2014].
  6. «MedKoo product information:PV-10» (en anglès). MedKoo Biosciences. [Consulta: 20 de gener de 2014].

Bibliografia[modifica | modifica el codi]

  • Ruiz-Mesa, J. D.; Sánchez-Gonzalez, J. Clinical Microbiology and Infection. Volume 11, Issue 3 (en anglès), març de 2005. 
  • Morgan, W. J. B.; MacKinnon, D. J.; Lawson, J. R.; Cullen, G. A.. The rose Bengal plate agglutination test in the diagnosis of brucellosis (en anglès). Vet Rec, 1969. 
  • Colmenero, J. D.; Reguera, J. M.. Combined use of rose of Bengal and indirect immunofluorescence in the diagnosis of brucellosis (en anglès). Enferm Infecc Microbiol Clin, 1989. 
  • Young, D. S.. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. 4th Edition (en anglès). AACC Press, 1995. 

Enllaços externs[modifica | modifica el codi]