NASBA

Nasba (amplificació basada en seqüències d'àcids nucleics), és un mètode d'amplificació de fragments de material genètic. Va ser desenvolupat per J. Compton el 1991, qui ho va definir com "una tecnologia de primer dependent que es pot utilitzar per a l'amplificació contínua d'àcids nucleics en una mescla única, a una temperatura única ".

Immediatament després de la seva invenció, el NASBA es va utilitzar per al diagnòstic ràpid i la quantificació del VIH-1 en el plasma de pacients.

Descripció

Nasba és una tècnica que permet l'amplificació exponencial d'una determinada mostra d'ARN o ADN, tot i que està especialment dissenyada per a l'amplificació de l'ARN.

Aquesta tècnica és més ràpida que la PCR i no necessita equip (thermocycler), ja que tot el procés té lloc a 41ºC (procés isotèrmic).

Reactius

NasBA requereix un nombre de components principals per a iniciar la reacció:

1. ARN de Mostra (o ADN) per amplificar.

2. Enzims per a catalitzar la reacció:

- Retrotranscriptasa (RT): aquest enzim reconeix la molècula d'ARN matriu i genera una molècula d'ADN complementària.

-Rnaiseh o II (RH): aquest enzim degrada l'ARN de l'ADN dúplex hetero.

-T7 POLIMERASA RNA (T7P): aquesta polimerasa s'uneix a la seqüència d'ADN i sintetitza la cadena d'ARN complementària.

3. Els alimentadors.

-Primer a+: aquesta imprimació té una seqüència complementària a l'extrem 5 ' de la molècula d'ARN.

-Primer b-: aquest imprimació és complementari a l'extrem 3 de l'ARN i també presenta una seqüència promotora de T7 en 5 '.

Etapes NASBA

NASBA es divideix en dues fases principals: la primera fase consta de sis passos únics i seqüencials, mentre que la segona fase presenta altres sis passos asíncrons i cíclics. Durant tot el procés es manté la mostra a una temperatura constant de 41oC. Les etapes NASBA són les següents:

1. primer pas: en primer lloc, estudi d'ARN (o ADN) (+), primer b-i tots els enzims (RT, RH i T7P) s'afegeixen. Durant aquest procés el primer b-reconeix el final 3 de l'ARN i s'uneix a ella.

2. segon pas: Quan la primera s'hibrida amb la seqüència d'ARN, RT reconeix aquesta seqüència i s'uneix a ella, iniciant un procés d'elongació i síntesi d'una molècula d'ADN complementària (-). La molècula d'ADN generada té un promotor T7 al final 5.

3. tercer pas: a continuació, el RH degrada la cadena d'ARN de l'hetero Duplex, alliberant la cadena d'ADN complementària de l'objectiu.

4. quart pas: posteriorment el primer a + està associat a la seva seqüència complementària i híbrida amb la cadena d'ADN (-).

5. cinquè pas: RT s'uneix a la imprimació i comença a polimerització per l'origen d'una nova cadena d'ADN complementari (cDNA) a l'anterior. La nova cadena generada presenta la seqüència promotora T7P.

6. sisè pas: T7 ARN polimerasa reconeix el seu promotor i s'associa amb ell, transcrivint múltiples ARN complementaris (-) de la cadena original.

Aquest pas completa la primera fase de NASBA, en la qual una mescla d'ARN objectiu (+) genera una mescla d'ARN blanc (-) i cDNA bicatenària amb un promotor T7.

Fase 1 del NASBA

7. setè pas: llavors el primer a + s'uneix a la final 3 de cada un dels ARN (-) objectiu generats en el procés anterior.

8. vuitè pas: les cadenes d'ARN hibridació amb l'a + primer són reconegudes per RT que inicia un procés de polimerització, generant noves cadenes d'ADN (+) que romanen com a ADN/ARN hetero duplex.

9. novè pas: RH degrada hetero duplex ARN, l'alliberament de les cadenes d'ADN objectiu (+).

10. desè pas: el b-primer s'uneix a l'ADN objectiu (+).

11. onzè pas: RT s'associa amb aquesta estructura i comença a polimerize generant noves cadenes d'ADN (-).

12. dotzè pas: T7P reconeix el seu promotor i comença a transcriure nou ARN complementari (-) a partir de l'objectiu original.

Aquesta segona fase és cíclica, de manera que la seqüència es copia milions de vegades i s'aconsegueix una amplificació molt eficient. A més en cada cicle la seqüència de destinació no es copia en dos com succeeix en la PCR però es copia tantes vegades com el T7P pot (sobre 1000).

Fase 2 del NASBA

Per amplificar l'ADN obtingut, s'afegeix un pas per desnaturalitzar-lo per provocar la hibridació de la sonda i provocar la retrotranscriptasa per començar a polimeritzar l'ADN.

Quantificació

El producte amplificat per NASBA pot ser quantificat per diferents mètodes:

• Electrochemoluminescència (ECL). Després de l'amplificació, la mostra es divideix en quatre i hibrida amb 4 sondes específiques dels 20 parells de bases de cada amplificador per separat. Aquestes sondes específiques s'uneixen a les esferes magnètiques amb streptavidin i les sondes no específiques amb el ruteni també s'afegeixen. El producte més amplificat d'aquestes sondes és capturat en un elèctrode i, després de l'aplicació d'una descàrrega, s'activa la reacció chemoluminescent. Només si el fragment de destinació s'ha amplificat, el ruthenium estarà prou a prop per produir la reacció chemoluminiscent. La llum separada és proporcional al nombre de còpies inicials de cada un. La càrrega viral es calcula per la seva relació amb tres controls externs.
• Fluorescència amb balises moleculars o oligobalises en temps real. Les finalitats complementàries i no complementàries s'utilitzen per a l'objectiu d'uns 5 parells de bases. La zona intermèdia és complementària per orientar l'àcid nucleics. D'aquesta manera, es crea un múltiplex amb dos fluochromes diferents i concentracions seriades.

Característiques de NASBA

NASBA és una tècnica que permet l'amplificació exponencial de l'ARN a partir d'una mostra inicial determinada. El factor d'amplificació és entre 500 i 1000 vegades. El nombre de molècules generades depèn del nombre de molècules inicials.

Aquesta tècnica té una sèrie d'avantatges:

-És un procés isotèrmic, és a dir, no es requereix termocycler, de manera que el procés es simplifica i és molt més econòmic.

-Està dissenyat específicament per a la detecció de virus d'ARN i altres microorganismes difícils de detectar (Chlamydias) en la detecció de mRNA. Per amplificar els objectius de l'ADN és necessari DENATUR per tal que RT enllés la imprimació b amb el promotor de la T7P.

NASBA té una sèrie de limitacions, ja que la seva sensibilitat i especificitat no són molt elevades, generant falsos positius i falsos negatius.

Bibliografia

• Coleman, WB i Tsongalis, GJ. Molecular Diagnostics: For the Clinical Laboratorian. Humana Press, 2006. ISBN 1-58829-356-4.  pàg. 47-56 i 65-74
• Butler, JM. Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR. Academic Press pgs 63-84, 2005. ISBN 0-12-147952-8. 
• Sambrook, Joseph; Russell, David W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a edició. Cold Spring Harbor (Nova York): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. ISBN 0-87969-576-5.