Electroforesi

Una científica utilitza un aparell d'electroforesi per a separar proteïnes segons la seua massa molecular.

L'electroforesi és un mètode analític que permet separar molècules d'una mescla en solució segons la seva càrrega elèctrica, estructura o massa molecular, mitjançant el seu desplaçament sobre una matriu a la qual s'aplica una diferència de potencial entre els seus extrems. Aquest fenomen electrocinètic fou observat per primera vegada l'any 1807 pels químics russos Strakhov i Reuss, que es van adonar que l'aplicació d'un camp elèctric constant causava que partícules d'argila disperses en aigua migressin. Aquest moviment és causat per la presència d'una interfície carregada entre la superfície de la partícula i el fluid circumdant.

L'any 1937, el bioquímic suec Arne Tiselius desenvolupar una tècnica analítica que aplicava aquest principi per a la separació de proteïnes i que el feu mereixedor del Premi Nobel de Química de 1948. Aquesta tècnica, i les seves variants, han esdevingut unes eines fonamentals en els laboratoris bioquímics. L'electroforesi és una tècnica útil per estimar la puresa d'una mostra, i és molt sensible a variacions de massa molecular, mida molecular, i fins i tot l'estructura proteica i dels àcids nucleics.

Història

Arne Wilhelm Kaurin Tiselius.

El moviment de partícules carregades en el si d'un camp elèctric fou observat per primera vegada ja el 1807 pels químics russos Piotr Ivanovitx Strakhov (1757-1813) i Ferdinand Frederic Reuss (1778-1852) a la Universitat Estatal de Moscou. Utilitzant un microscopi, observaren que l'aplicació d'un camp elèctric constant feia que les partícules d'argila disperses en aigua migressin. Reuss també descobrí el flux oposat d'aigua (electroosmosi). El físic alemany Georg Hermann Quincke (1834-1924) demostrà que la velocitat de migració d'una partícula carregada en un camp elèctric està relacionada linealment amb el gradient de potencial elèctric i es veu afectada pel valor del pH de la solució. El 1892, H. Picton i S. E. Linder van observar que l'hemoglobina, una proteïna acolorida, es movia en un tub en U, omplert amb una solució electrolítica i col·locat en un camp elèctric. El 1899, el biòleg britànic William Bate Hardy (1864-1934) informà del moviment de les globulines sèriques en un camp elèctric i demostrà que la càrrega elèctrica d'una proteïna podia canviar de positiva a negativa quan es variava el valor del pH. El 1909, el científic alemany Leonor Michaelis (1875-1949) introduí el terme «electroforesi». Aquest terme està compost de les paraules gregues ἤλεκτρον ḗlektron ‘ambre’, que en l'antiguitat estava relacionat amb l'electricitat, i φόρησις phórēsis ‘transport’.

Partint d’aquestes experimentacions primigènies, el bioquímic suec Arne Tiselius (1902-1971) desenvolupà l’aparell homònim per a l’electroforesi de gradient mòbil o electroforesi en fase lliure, el qual fou descrit durant la dècada de 1930 en una dissertació titulada “A New Apparatus for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures”. Tiselius fou guardonat per aquest treball amb el Premi Nobel de Química del 1948. Aquest mètode s'expandí amb lentitud fins a l'adveniment de procediments eficaços d'electroforesi de zona entre els decennis de 1940 i 1950, els quals empraren paper de filtre o gels com a medis de suport. Ja a la dècada de 1960, unes tècniques d’electroforesi en gel progressivament més sofisticades permeteren la separació de molècules biològiques basant-se en subtils propietats físiques i químiques, tals com el marcatge proteic (fingerprinting), les tècniques de transferència (blotting), la seqüenciació de l’ADN i moltes d’altres. Encara en ple segle xxi, el desenvolupament de nous processos de separació i tècniques d’anàlisi química basats en l’electroforesi no ha cessat de progressar.

Teoria

El fenomen de l'electroforesi es dona en partícules carregades superficialment quan hom aplica un camp elèctric extern que hi exerceix una força electroestàtica de Coulomb. D'acord amb la teoria de la doble capa elèctrica, totes les càrregues superficials en líquids són apantallades per una capa difusa d'ions, que té la mateixa càrrega absoluta que la superficial, però de signe oposat. El camp elèctric també exerceix una força sobre els ions de la capa difusa que té direcció oposada a la que actua sobre la càrrega de superfície. Aquesta última força no s'aplica realment a la partícula, sinó als ions de la capa difusa situats a poca distància de la superfície de la partícula, i part d'ella es transfereix a la superfície de la partícula a causa de la tensió viscosa. Aquesta part de la força també es diu força de retardament electroforètic.

Si considerem la fricció hidrodinàmica de les partícules en moviment a causa de la viscositat del fluid, en cas de tenir un nombre de Reynolds ($Re$) baix i una intensitat del camp elèctric ($E$) moderada, la velocitat ($v$) d'una partícula és simplement proporcional al camp aplicat. La mobilitat elèctrica ($\mu$), relació entre la velocitat d'una partícula i el camp elèctric aplicat, es defineix, doncs, com:

Representació del transport d'un ió en un electròlit mitjançant un mecanisme viscós i sota la influència d'un camp elèctric extern.

$$\mu ={v \over E}$$

Per proteïnes, l'equació també es pot descriure emprant la càrrega elèctrica ($Z$) i el coeficient de fricció ($f$), estretament relacionat amb la mida i l'estructura de la proteïna:

$$\mu ={Z \over f}$$

Les molècules més petites es mouen més ràpid que les grosses i, per tant, arriben abans a l'ànode. Això permet determinar la massa molecular d'una partícula desconeguda.

Tipologies d'electroforesi

L’electroforesi es pot classificar en quatre tipologies principals, segons la naturalesa de la solució amortidora emprada o bé en funció de com aquesta incideix en la mobilitat de les partícules amb càrrega elèctrica. Qualsevol d'elles es pot executar en una o dues dimensions (2D), essent aquesta darrera una segona separació perpendicular a la primera dimensió. Per a mostres clíniques o de camp que requereixin una anàlisi i caracterització exhaustives, i de les quals es disposi de quantitats limitades, l'electroforesi bidimensional pot aportar una major resolució i densitat d'informació.

Electroforesi de gradient mòbil

Electroforesi de gel.

L’electroforesi de gradient mòbil, o electroforesi en fase lliure, representa la tècnica electroforètica primigènia. El manteniment d'un valor de pH constant durant el procediment permet realitzar la separació tant en solució lliure com en tubs o capil·lars. Un tret distintiu de l’electroforesi en fase lliure és la capacitat de monitorar la mobilització de partícules discretes sense la interferència de factors externs aliens al procés de separació. No obstant això, la mescla de les mostres en la dissolució amortidora comporta una resolució de separació precària i l'aparició de corrents de convecció, fet que pot derivar en la recombinació de components o partícules de propietats anàlogues.

Electroforesi de zona

Comparativa de l'electroforesi de zona, la isotacoforesi i l'enfocament isoelèctric de tres espècies diferents representades en verd, blau, vermell. Les fletxes indiquen la velocitat relativa i el sentit de l'electroforesi. En l'electroforesi de zona (CZE), la separació depèn de les seves mobilitats electroforètiques. En la isotacoforesi (ITP), la separació depèn de les mobilitats electroforètiques, però romanen compresos entre l'electròlit terminador i l'electròlit de guia. En l'enfocament isoelèctric (IEF), es genera un gradient de pH i les espècies se centren en la ubicació on el pH coincideix amb el seu punt isoelèctric.

L’electroforesi de zona (EZ) guarda una analogia amb la de gradient mòbil pel que fa a l'ús d'una solució amortidora homogènia per a la separació proteica. Per tal d'atenuar els corrents de convecció i evitar la difusió incontrolada de la mostra, aquest format utilitza freqüentment un suport o matriu (acetat de cel·lulosa, gel d’agar-agar, gel de midó, acrilamida o paper) damunt el qual és aplicada la mostra. En la majoria de supòsits, la matriu exerceix, a més, una acció de tamisatge addicional que condiciona la separació electroforètica. En l'EZ, les mostres es troben immerses en el tampó electroforètic i se separen dins la matriu durant un lapse de temps determinat. En aplicar-se un corrent elèctric, les mostres migren a velocitats diferents segons la seva massa i càrrega. Un cop finalitzat el procés, els components de la mostra amb propietats homòlogues s'agrupen en zones diferenciades.

L'electroforesi en gel, que utilitza una matriu polimèrica de tamisatge com a suport, n'és un exemple paradigmàtic. Atesa la seva senzillesa i versatilitat, aquest mètode s'empra bastament en la recerca i la pràctica clínica de la bioquímica i la biologia molecular. Tanmateix, a causa de l'ús d'un medi de suport, l'EZ no resulta idònia per a la determinació del punt isoelèctric de pèptids o proteïnes, ni per a l'anàlisi de la mobilitat de partícules iòniques d'interès.

Isotacoforesi

En la isotacoforesi (ITP), tots els ions migren a una velocitat constant. En aquesta tècnica, una mostra d'interès es disposa entre dos electròlits de solucions amortidores no homogènies: l'electròlit de referència (leading) i l'electròlit terminal (terminating). Les partícules de la mostra adquireixen la mateixa càrrega que ambdós electròlits. El corrent elèctric tindrà una incidència superior sobre l'electròlit de referència que sobre les partícules de la mostra o l'electròlit terminal. Durant la ITP, les partícules carregades es desplacen de manera seqüencial segons la seva mobilitat elèctrica decreixent; això genera una àrea contínua de partícules de característiques equivalents confinades entre les regions ocupades pels ions de referència i els terminals. Les dades d'isotacoforesi es representen mitjançant un gràfic de la intensitat del camp elèctric respecte al temps, on cada regió identifica la naturalesa de la partícula i la seva concentració respectiva.

Enfocament isoelèctric

Aquest diagrama il·lustra el procediment de l'electroforesi en gel. Aquesta tècnica s'empra per a l'obtenció de perfils d'ADN (DNA fingerprinting), una eina de gran utilitat en la investigació criminalística, atès que cada individu presenta patrons genètics distintius. L'ADN es pot extreure de qualsevol mostra de fluid corporal (per exemple, sang, semen o saliva). Posteriorment, l'ADN se sotmet a l'acció d'enzims de restricció i s'amplifica mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR). La mescla resultant dels fragments d'ADN i els enzims de restricció es diposita en els pous del gel d'agarosa, procés que indueix un canvi físic en lloc d'una reacció química. Seguidament, s'aplica un corrent elèctric al gel a través d'una font d'alimentació. Atès que l'ADN posseeix una càrrega negativa, aquest migra cap al pol positiu (ànode). Els fragments de massa molecular més gran es desplacen amb més lentitud i romanen a la part superior de la matriu, mentre que els fragments més petits progressen amb més celeritat i se situen a la part inferior. Les bandes resultants es tenyeixen; la intensitat de la tonalitat de cada banda és indicativa de la quantitat d'ADN que conté.

Es tracta d'una tècnica electroforètica que utilitza un gradient de pH per concentrar la mostra des de l'ànode cap al càtode. L’enfocament isoelèctric o electroenfocament o isoelectroenfocament (IEF, per les seves sigles en anglès isoelectric focusing) és aplicable exclusivament a substàncies amfòteres, atesa la seva capacitat per cedir o acceptar protons. Entre les biomolècules amfòteres destaquen els aminoàcids i els grups d'àcid carboxílic presents en pèptids i proteïnes. Un cop establerts el gradient de pH i el corrent elèctric, la mostra amfòtera migrarà cap al càtode o cap a l'ànode en funció de la seva càrrega neta. Tant la velocitat com la mobilitat elèctrica de les molècules amfòteres s'anul·len quan la càrrega neta és zero en el punt isoelèctric, moment en què cessa la migració.

Modalitats d'electroforesi

S’han desenvolupat diverses modalitats d’electroforesi amb la finalitat de fraccionar distintes tipologies de biomolècules, avaluar-ne les propietats fisicoquímiques i investigar-ne la interacció amb lligands d'interès. A continuació, s'exposen diversos mètodes basats en formats electroforètics diferenciats.

Electroforesi en gel

L’electroforesi en gel és la tècnica d’elecció quan es pretén mantenir la constància del pH en la solució amortidora. La matriu de separació, gràcies a la seva naturalesa porosa, actua com un filtre que reté les partícules de grans dimensions mentre permet el trànsit de les més petites durant la separació electroforètica. El gel es configura habitualment en formats de placa o tires fines que contenen pous per al dipòsit de les mostres. Abans d’iniciar el procés, el gel se submergeix en un solució amortidora o bé les mostres s'introdueixen en els pous prèviament a l'aplicació del corrent elèctric. Aquesta tècnica permet la separació de substàncies en funció de la seva massa molecular. Atesa la seva simplicitat operativa i gran versatilitat, l’electroforesi en gel constitueix una de les metodologies més esteses tant en la recerca acadèmica com en el diagnòstic clínic de rutina.

Anàlisi de conglomerats de les soques d'Escherichia coli enteroagregativa a partir del perfil de restricció obtingut mitjançant electroforesi en gel de camp polsat.

Electroforesi en gel de camp polsat

L’electroforesi de camp polsat (PFGE) és una variant de l'electroforesi en gel que permet separar molècules d'ADN de grans dimensions amb l'aplicació de camps elèctrics alternants a una matriu, generalment de gel d'agarosa.

Electroforesi capil·lar (EC)

L’electroforesi capil·lar d’alt rendiment utilitza un capil·lar de dimensions minúscules submergit en una solució electrolítica. Aquesta metodologia permet l’execució de les quatre tipologies electroforètiques descrites anteriorment. Generalment, el capil·lar presenta una longitud d'entre 20 i 30 cm, amb un diàmetre intern d'entre 25 i 75 μm. La separació es produeix un cop la mostra s'injecta en el capil·lar mitjançant l'aplicació d'alt voltatge o alta pressió. Els components de la mostra se separen en funció de la longitud del capil·lar i de la tècnica específica emprada. Un detector situat a l'extrem oposat registra automàticament la identitat dels components i el seu temps de retenció. Gràcies a l'estretor del conducte, l'EC requereix volums de mostra ínfims, permet anàlisis d'alt rendiment i és susceptible d'automatització integral.

Immunoelectroforesi

L’immunoelectroforesi és una variant que permet la separació d’antígens, tals com proteïnes o pèptids, basant-se en la seva interacció específica amb anticossos o immunoglobulines (Ig). La precipitació del complex antigen-anticòs s'esdevé quan l'antigen s'uneix a l'anticòs homòleg en una proporció estequiomètrica determinada, coneguda com a punt d'equivalència.

Electroforesi d'afinitat

L'electroforesi d'afinitat es fonamenta en la separació de biomolècules que presenten una interacció d'unió específica amb una altra molècula. Aquest mètode aprofita el fet que, quan una biomolècula (com àcids nucleics, proteïnes, pèptids o polisacàrids) s'acobla a un altre lligand, la seva mobilitat elèctrica s'altera. Aquesta variació en la mobilitat es reflecteix directament en el patró electroforètic resultant, permetent així l'estudi de les constants d'afinitat.

Vegeu també

• Gel d'electroforesi
• SDS-PAGE
• Isoelectroenfocament
• Southern blot
• Northern blot
• Western blot

Enllaços externs

• Llista de mobilitats relatives