Actina

Actina G (codi PDB: 1j6z). Al centre actiu s'hi representen les molècules d'ADP i el catió divalent.

Actina F; representació de la superfície d'una repetició de 13 subunitats basada en el model de Ken Holmes del filament d'actina.

L'actina és una proteïna globular que forma els microfilament, un dels tres components fonamentals del citosquelet de les cèl·lules dels organismes eucariotes. S'expressa a totes les cèl·lules dels organismes pluricel·lulars, especialment a les fibres musculars, on participa en la contracció muscular juntament amb la miosina i altres elements. Pot trobar-se en forma lliure, anomenada actina G, o formant part de polímers lineals anomenats microfilaments o actina F, que són essencials per funcions cel·lulars tan importants com la mobilitat i la contracció de la cèl·lula durant la divisió cel·lular.

De la importància capital de l'actina dóna compte el fet que en el contingut proteic d'una cèl·lula suposa sempre un elevat percentatge i que la seva seqüència està molt conservada, és a dir, que ha canviat molt poc al llarg de l'evolució. Per ambdues raons es pot dir que la seva estructura ha estat optimitzada. Sobre aquesta es poden destacar dos trets peculiars: és un enzim que hidrolitza ATP, la "moneda universal de l'energia" dels processos biològics, fent-ho molt lentament. Però al mateix temps necessita d'aquesta molècula per mantenir la seva integritat estructural. Adquireix la seva forma eficaç en un procés de plegament gairebé dedicat. A més és la que estableix més interaccions amb altres proteïnes de totes es coneixen, el que li permet exercir les més variades funcions que arriben a gairebé tots els aspectes de la vida cel·lular. La miosina és un exemple de proteïna que uneix actina. Un altre exemple és la vilina, que pot entrellaçar l'actina en fas o bé tallar els filaments d'actina, depenent de la concentració de catió calci en el seu entorn.

Formant microfilaments en un procés dinàmic proporciona una bastida que dota la cèl·lula d'una forma amb possibilitat de remodelar ràpidament en resposta al seu entorn o senyals de l'organisme, per exemple, augmentant la superfície cel·lular per a l'absorció o proporcionant suport a l'adhesió de les cèl·lules per a formar teixits. Sobre aquest bastida es poden ancorar altres enzims, orgànuls com el cili, dirigir la deformació de la membrana cel·lular externa que permet la ingestió cel·lular o la citocinesi. També pot produir moviment, bé per ella mateixa o ajudada de motors moleculars. D'aquesta manera contribueix a processos com el transport intracel·lular de vesícules i orgànuls i la contracció muscular, o la migració cel·lular, important en el desenvolupament embrionari, reparació de ferides o invasivitat del càncer. L'origen evolutiu d'aquesta proteïna es pot rastrejar en les cèl·lules procariotes, on hi ha equivalents. Finalment és important en el control de l'expressió gènica.

Un bon nombre de malalties tenen com a base alteracions genètiques en al·lels dels gens que governen la producció de l'actina o de les seves proteïnes associades, i també essencial en el procés d'infecció d'alguns microorganismes patògens. Les mutacions en els diferents gens d'actina presents en humans ocasionen miopaties, variacions en la grandària i la funció cardíaca i sordesa. Els components del citoesquelet també tenen relació amb la patogenicitat de bacteris intracel·lulars i virus, especialment en processos relacionats amb l'evasió de la resposta del sistema immune.

Història

El premi Nobel Szent-Györgyi, co-descobridor amb Brúnó Straub de l'actina.

L'actina va ser observada experimentalment per primera vegada en 1887 per W.D. Halliburton, que va extraure una proteïna muscular que coagulava preparacions de miosina, denominant-lo "ferment de la miosina". No obstant, Halliburton va ser incapaç d'efectuar la caracterització de les seues observacions, i per això el descobriment s'atribueix a Brúnó F. Straub, llavors un jove bioquímic que treballava en el laboratori d'Albert Szent-Györgyi en l'Institut de química mèdica de la Universitat de Szeged, en Hongria.

En 1942, Straub va desenvolupar una nova tècnica per a l'extracció de proteïnes musculars que li permetia aïllar quantitats substancials d'actina relativament pura. Aquest mètode és el mateix que essencialment s'utilitza en els laboratoris actualment. Szent-Györgyi havia descrit prèviament una forma més viscosa de miosina, produïda per extraccions lentes en múscul, com "miosina activada" i ja que la proteïna de Straub produïa l'efecte activador, la va denominar actina. La viscositat disminuïa si s'afegia ATP a la barreja d'ambdues proteïnes, coneguda com actomiosina. El treball d'ambdós no va poder ser publicat en els països occidentals a causa del ambient bèl·lic de la Segona Guerra Mundial, eixint a la llum en 1945 quan va ser publicat com suplement de Acta Physiologica Scandinavica. Straub va continuar treballant en l'actina fins a 1950, publicant que podia unir-se a l'ATP i que, durant la polimerització de la proteïna per a formar microfilaments, es hidrolitzava a ADP + P_i, el qual romania unit al microfilament. Straub va suggerir que aquesta reacció ocupava un paper en la contracció muscular, però açò només és cert en el cas del múscul llis i no va ser verificat experimentalment fins a 2001.

La seqüència d'aminoàcids va ser completada per Elzinga i col·laboradors en 1973, i la estructura cristalogràfica de l'actina G va ser determinada en 1990 per Kabsch i col·laboradors, encara que es tractava d'un cocristall en el qual formava un complex amb la desoxirribonucleasa I, sent proposat un model el mateix any per a l'actina F per Holmes i els seus col·laboradors. Aquest procediment de cocristalització amb diferents proteïnes va ser emprat repetidament durant els següents anys, fins que en 2001 es va assolir cristal·litzar la proteïna aïllada juntament amb ADP. Va ser possible gràcies a l'ocupació d'un conjugat de rodamina que impedia la polimerització bloquejant l'aminoàcid cys-374. Aqueix mateix any es va produir la defunció de Christine Oriol-Audit, la investigadora que en 1977 va aconseguir cristal·litzar per primera vegada l'actina en absència d'ABP's. Els cristalls van resultar massa petits per a la tecnologia de l'època.

Encara que actualment no existeix un model d'alta resolució de la forma filamentosa, l'equip de Sawaya va realitzar en 2008 una aproximació més exacta basant-se en múltiples cristalls de dímers d'actina que contacten en diferents llocs. Aquest model va ser refinat pel propi autor i per Lorenz. Altres enfocaments, com l'ús de microscopia crioelectrònica o radiació sincrotró han permès recentment augmentar el nivell de resolució i comprendre amb major profunditat la naturalesa de les interaccions i els canvis conformants implicats en la formació del filament d'actina.

Estructura

L'actina és una de les proteïnes més abundants entre els eucariotes i es troba present en tot el citoplasma. De fet, en les fibres musculars representa el 20% en pes total de les proteïnes, en altres cèl·lules animals, està entre l'1 i el 5%. No obstant això, no existeix un únic tipus d'actina, sinó que els seus gens codificants estan definits per una família multigènica (família que, en plantes, alberga més de 60 elements, entre gens i pseudogens i, en humans, més de 30). Això significa que la informació genètica de cada individu té instruccions per generar variants de l'actina (anomenades isoformes) que posseiran funcions lleugerament diferents. D'aquesta manera, els organismes eucariotes expressen diferents gens que donen lloc a: l'actina α, que es troba en estructures contràctils; l'actina β, a la vora en expansió de les cèl·lules que empren la projecció d'estructures mòbils com a mètode de mobilitat; i l'actina γ, en els filaments de les fibres d'estrès. A més de les similituds existents entre les isoformes d'un organisme, també hi ha una conservació evolutiva pel que fa a estructura i funció entre organismes de fins i tot dominis diferents de l'eucariota: a bacteris es coneix l'homòleg MreB, una proteïna que és capaç de polimeritzar en microfilaments, i en arqueobacteris hi ha un representant (Ta0583) encara més semblant a les actines d'eucariotes.

L'actina es presenta a la cèl·lula en dues formes: com monòmers globulars denominats actina G i com polímers filamentosos anomenats actina F (és a dir, filaments compostos de multitud de monòmers d'actina G). L'actina F pot denominar també microfilament. A cada bri d'actina s'uneix una molècula d'adenosina trifosfato (ATP) o de adenosina difosfat (ADP) al seu torn associada a un catió Mg2 +. De les diferents combinacions possibles entre les formes d'actina i el nucleòtid trifosfat, en la cèl.lula predominen l'actina G-ATP i l'actina F-ADP.

Actina G

Pel que fa a la seva estructura molecular, l'actina G té una aparença globular al microscopi electrònic de rastreig, no obstant això, mitjançant cristalografia de raigs X pot apreciar-se que està composta de dos lòbuls separats per una esquerda, l'estructura conforma el plec ATPasa, un centre de catàlisi enzimàtica capaç d'unir l'ATP i Mg2 i hidrolitzar el primer a ADP més fosfat. Aquest plec és un motiu estructural conservat que també està present en altres proteïnes que interaccionen amb nucleòtids trifosfat com l'hexoquinasa (un enzim del metabolisme energètic) o les proteïnes Hsp70 (una família de proteïnes que contribueixen a que altres proteïnes tinguin estructures funcionals). L'actina G només és funcional quan posseeix o bé ADP o bé ATP en el seu esquerda, no obstant això, en la cèl·lula predomina l'estat unit a ATP quan l'actina es troba lliure.

Model molecular de cintes d'actina de múscul esquelètic de conill segons Graceffa i Domínguez, 2003. Es destaquen els quatre subdominis, així com els extrems N i C terminal i el lloc d'unió a ATP. La molècula està orientada segons la convenció que s'adopta normalment, quedant en la part superior l'extrem - (punta de fletxa) i en la inferior l'extrem + (barba).

L'actina cristal per Kabsch, que és la més utilitzada com a model en estudis estructurals, ja que va ser la primera a ser purificada, procedeix del múscul esquelètic de conill. Té unes dimensions aproximades de 67 x 40 x 37 Å, un massa molecular de 41785 Da i un punt isoelèctric estimat en 4,8. La seva càrrega neta a pH = 7 és de -7.

Estructura primària

La seqüència d'aminoàcids completa d'aquest tipus d'actina va ser determinada per Elzinga i col.laboradors el 1973, i afinada en treballs posteriors pel mateix autor. Conté 374 residus d'aminoàcids. El seu extrem N-terminal és molt àcid. Comença amb un aspartat acetilat en el seu grup amino, mentre que el seu C-terminal és bàsic, format per una fenilalanina precedida per una cisteïna de certa importància funcional. Tots dos extrems se situen en una posició molt propera dins del subdomini I. Pel que fa a aminoàcids anòmals, cal destacar una Nτ-metilhistidina en posició 73.

Estructura terciària-dominis

Està formada per dos dominis coneguts com gran i petit, separats per una esquerda en el centre se situa el lloc d'unió a l'ATP-ADP + Pi. Per sota d'aquest hi ha una escotadura de menor profunditat anomenada "solc". Quan es troben en forma nativa, malgrat el seu nom, tots dos tenen una mida equiparable.

En els estudis topològics, per convenció, la proteïna s'orienta de manera que el domini major queda a l'esquerra, mentre que el menor es situa a la dreta. En aquesta posició, el domini petit es divideix al seu torn en el subdomini I (posició inferior, residus 1-32, 70-144 i 338-374) i subdomini II (posició superior, residus 33-69). El domini major també es divideix en dos, el subdomini III (inferior, residus 145-180 i 270-337) i el subdomini IV (superior, residus 181-269). La zona exposada dels subdominis I i III es denomina extrem "barbat", mentre que a la dels subdominis II i IV se l'anomena extrem "en punta de fletxa". Aquesta denominació fa referència al fet que a causa de la petita massa del subdomini 2, l'actina adquireix polaritat, que es discutirà posteriorment en parlar de la dinàmica d'acoblament. Alguns autors nomenen els subdominis com Ia, Ib, IIa i IIb, respectivament.

Altres estructures destacades

• L'estructura supersecundaria més destacada és una β-làmina de cinc cadenes que es componen d'un β-meandre i una unitat β-α β dextrogira. És present en ambdós dominis. Això suggereix que la proteïna va sorgir per duplicació gènica.
• El lloc d'unió al adenosín nucleòtid es troba entre dues estructures en forma de forqueta β pertanyents als dominis 1 i 3. Els residus implicats són Asp11-Lys18 i Asp154-His161 respectivament.
• Just a sota del nucleòtid es troba el lloc d'unió al catió divalent, que in vivo és amb més probabilitat el Mg2 + o el Ca2 + mentre que in vitro és el format per una estructura quelant en què contribueixen la Lys18 i dos oxígens dels fosfats α i β del nucleòtid. Aquest calci està coordinat amb sis molècules d'aigua que es troben retingudes pels aminoàcids Asp11, Asp154, i Gln137. Juntament amb el nucleòtid forma un complex que restringeix els moviments d'una regió anomenada frontissa o hinge, situada entre els residus 137 i 144, mantenint d'aquesta manera la forma nativa de la proteïna, fins al punt que la seva retirada desnaturalitza el monòmer d'actina . Aquesta regió també és important, perquè determina les conformacions "oberta" o "tancada" de l'esquerda de la proteïna.
• Amb gairebé tota probabilitat hi ha almenys altres tres centres amb menor afinitat (intermèdia) i altres de baixa afinitat per cations divalents. S'ha especulat sobre el paper d'aquests centres en la polimerització de l'actina actuant en l'etapa d'activació.
• En el subdomini 2 hi ha una estructura, anomenada bucle-D o D-loop pel fet que s'uneix a la ADNasa I, situada entre els residus His40 i Gly48 que apareix com un element desordenat en la majoria dels cristalls i com una làmina β quan està formant complex amb la ADNasa I. Segons Domínguez et al., L'esdeveniment clau de la polimerització seria la propagació d'un canvi conformacional des del centre d'unió al nucleòtid fins a aquest domini, que passaria de ser un bucle a una hèlix. Aquesta teoria sembla ser refutada per altres treballs.

Fitxer:Actin18 new rot.PNG

Monòmer d'actina (variades) en el context d'un microfilament, en el qual la resta de subunitats apareixen en colors blau i verd.

Actina F

Una descripció clàssica afirma que l'actina F té una estructura filamentosa interpretable com una hèlix levogira monocatenari amb gir de 166 º i increment de 27,5 Å o bé com una hèlix dextrogira bicatenaria amb mig pas de rosca de 350-380 Å, estant cada actina envoltada de quatre. La simetria del polímer d'actina, que és d'unes 2,17 subunitats per volta d'hèlix és incompatible amb la formació de cristalls, que només és possible quan aquestes són exactament 2, 3, 4 o 6 subnidades per volta. Per tant, s'han d'efectuar models interpretant dades procedents de tècniques que salven aquests inconvenients, com la microscòpia electrònica, la criomicroscòpia electrònica, cristalls de dímers en diferents posicions o difracció de raigs X. Cal precisar que parlar d'una "estructura "no és correcte per una cosa tan dinàmic com un filament d'actina. En realitat s'hauria de parlar de diferents estats estructurals, entre els quals la dada més constant és l'increment de 27,5 Å, mentre que la rotació de les subunitats mostra una considerable variabilitat, i és normal observar desplaçaments de fins al 10% de la seva posició ideal. Algunes proteïnes, com la cofilina, semblen incrementar l'angle de gir, però novament es pot interpretar que, en lloc d'això, estabilitzen alguns "estats estructurals" normals. Aquests podrien ser importants en el procés de polimerització.

Pel que fa al radi de gir o gruix del filament, les mesures són més controvertides: mentre els primers models li assignaven una longitud de 25 Å, dades actuals de difracció de raigs X recolzats per criomicroscòpia electrònica coincideixen en uns 23,7 Å. Aquests mateixos estudis han determinat amb força precisió els punts de contacte entre monòmers. Uns s'estableixen amb unitats de la mateixa cadena, entre l'extrem "barbado" d'un monòmer i l'extrem "en punta de fletxa" del següent, mentre que els monòmers de cadenes adjacents fan contacte lateralment mitjançant projeccions del subdomini 4, sent les més importants la formada pel C-terminal i un enllaç hidrofòbic format per tres cossos en els quals intervenen els residus 39-42, 201-203 i 286. Per formar part d'un filament, segons aquest model, els monòmers estarien en una configuració anomenada "plana", en què els subdominis giren entre si, i que també sembla trobar-se al homòleg bacterià de l'actina MreB.

Ja que totes les subunitats d'un microfilament apunten cap al mateix extrem, es diu que el polímer presenta polaritat en la seva estructura. Aquest fet dóna lloc a una convenció: es nomena a l'extrem que posseeix una subunitat d'actina exposant el lloc pel qual uneix ATP al medi com a «extrem (-)» mentre que en l'oposat, en el qual l'esquerda està dirigida a un altre monòmer adjacent, és el «extrem (+)». La denominació« en punta de fletxa »i« barbado »dels extrems dels microfilaments es deu al seu aspecte al microscopi electrònic de transmissió quan es processen mitjançant una tècnica anomenada «decoració». Aquest mètode consisteix en l'addició d'elements S1 de la miosina en teixits fixats amb àcid tànnic, aquesta miosina s'uneix de forma polar als monòmers d'actina, el que dóna lloc a una configuració semblant a fletxes amb plomes al llarg de tot el seu fust , on el fust correspondria a l'actina i les plomes a la miosina. D'aquesta manera, l'extrem del microfilament que queda sense miosina sobresortint s'interpreta com la punta de la fletxa, mentre l'oposat s'anomena barbado.

En el múscul, el filament helicoïdal de l'actina F conté també una molècula d'tropomiosina, una proteïna d'una longitud de 40 nanòmetres que s'enrotlla al voltant de l'hèlix d'actina F. Durant l'estat de repòs cel lular, la tropomiosina recobreix els llocs actius de l'actina de manera que no s'aconsegueix la interacció actina-miosina que produeix la contracció muscular. Unides al llarg del fil de tropomiosina hi ha altres molècules proteiques, les troponines, complexos de tres polímers: troponina I, troponina T i troponina C.

Plegament

Model de cintes obtingut mitjançant l'aplicació del programa PyMOL a les dades cristal de la prefoldina de la arqueja Pyrococcus horikoshii. S'observen les sis estructures supersecundarias en forma d'hèlix atropellada "penjant" dels barrils β centrals. La literatura sol comparar-les amb els tentacles d'una medusa. Pel que s'ha vist mitjançant microscòpia electrònica, la prefoldina d'eucariotes té una estructura molt similar.

L'actina pot adquirir espontàniament una gran part de la seva estructura terciària. No obstant això, mostra un comportament molt especial i gairebé únic en la forma en que adquireix la seva forma plenament funcional a partir de la seva forma nativa recent sintetitzada. La raó d'una ruta tan especial podria ser la necessitat d'evitar la presència de monòmers d'actina mal plegats, que serien tòxics ja que podrien actuar de terminadors inadequats de la polimerització. En qualsevol cas, és clau per a l'estabilitat del citoesquelet, i no només això, sinó que podria ser un procés essencial per a la coordinació del cicle cel.lular.

Per això empra obligadament un tipus de chaperonina (proteïna que ajuda a altres a plegar) citosòlica del grup II, la CCT, formada per un doble anell de vuit subunitats diferents (heterooctamérico) que es distingeix de les altres xaperones moleculars, i en especial de la seva homòloga en arqueges GroEL en què no necessita d'una co-chaperona que actuï de tapadora sobre la cavitat central catalítica. Accepta substrats unint-se a ells mitjançant dominis específics, de manera que en principi es va pensar que era exclusiva d'actina i tubulina, encara que actualment s'ha vist per immunoprecipitació que almenys interactua amb un gran nombre de polipèptids, possiblement com a substrats. Actua mitjançant canvis conformacionals dependents d'ATP, necessitant de vegades de diverses rondes d'alliberament i catàlisi per completar el seu treball.

Per al seu correcte plegament, l'actina i la tubulina també necessiten específicament del concurs d'una altra proteïna, la prefoldina, un complex heterohexamérico (format per sis subunitats diferents), i tan específicament que fins i tot han coevolucionat. En el cas de l'actina, s'uneix immediatament a ella mentre encara s'està traduint, aproximadament quan té una longitud de 145 aminoàcids, que són els corresponents al domini N-terminal.

S'empren subunitats de reconeixement diferents per l'actina i la tubulina, encara solapades. Probablement en el cas de l'actina es tracta de les subunitats PFD3 i PFD4 que s'uneixen a l'actina en dos llocs, l'I, entre els residus 60-79 i el II, entre els residus 170-198. L'actina es reconeix, càrrega i lliurament a la CCT en conformació oberta per la part interna de l'extrem dels "tentacles" de la prefoldina (veure imatge i nota al peu). [A] El contacte en el moment del lliurament és tan breu que no s'arriba a formar un complex ternari, alliberant-la prefoldina immediatament.

Model molecular de cintes del domini γ apical de la chaperonina CCT.

Posteriorment, la chaperonina citosòlica (CCT) efectua el plegament de l'actina de forma seqüencial, i formant unions amb les subunitats, en comptes de tancar-la en la seva cavitat. [b] Per a això té zones específiques de reconeixement en el seu domini β apical. La primera etapa del plegament consistiria en el reconeixement dels residus 245-249. Posteriorment, altres determinants establirien contacte. Tant l'actina com la tubulina s'uneixen a la CCT en conformacions obertes en absència d'ATP. En el cas de l'actina, a cada canvi conformacional s'uneix a dues subunitats, a diferència de la tubulina, que ho fa a quatre. L'actina té seqüències d'unió específiques, interactuant amb les subunitats CCTδ i β o bé amb CCTδ i CCTε. Després de la unió de AMP-PNP a la CCT, els substrats van movent-se per la cavitat de la chaperonina. Sembla ser també que en el cas de l'actina fa falta la proteïna CAP com un possible cofactor en els estadis finals del plegament de l'actina.

Encara no es coneix amb exactitud la regulació d'aquest procés, però se sap que la proteïna PhLP3 (proteïna semblant a la fosducina) regula la seva activitat inhibint-la, mitjançant la formació d'un complex ternari.