Unitat formadora de colònies: diferència entre les revisions
mCap resum de modificació |
Cap resum de modificació |
||
| Línia 6: | Línia 6: | ||
== Generalitats == |
== Generalitats == |
||
El terme viables fa referència a l’habilitat de les nostres cèl·lules de multiplicar-se per [[fissió binària]] en condicions controlades, a diferència d’altres mètodes de recompte com ara la [[microscòpia òptica]] on es consideren tant cèl·lules viables com no.<ref>{{Ref-web|títol=Unidades formadoras de colonias - Labster Theory|url=https://theory.labster.com/cfu-es/|consulta=2022-11-15}}</ref> |
El terme viables fa referència a l’habilitat de les nostres cèl·lules de multiplicar-se per [[fissió binària]] en condicions controlades, a diferència d’altres mètodes de recompte com ara la [[microscòpia òptica]] on es consideren tant cèl·lules viables com no.<ref>{{Ref-web|títol=Unidades formadoras de colonias - Labster Theory|url=https://theory.labster.com/cfu-es/|consulta=2022-11-15}}</ref><ref name=":7">{{Ref-web|títol=AROUND LAB NEWS / EN » The difference between CFU and a bacterium cell|url=http://www.aroundlabnews.com/en/the-difference-between-cfu-and-a-bacterium-cell/|consulta=2022-11-16|llengua=en}}</ref> |
||
Habitualment els [[Cultiu cel·lular|cultius]] tant bacterians com fúngics contenen moltes cèl·lules viables, és a dir, que cada objecte d’estudi té una càrrega microbiana associada. A vegades aquesta càrrega implica tantes cèl·lules viables que no ens permetrien distingir-les en una placa de cultiu, és per això que en la majoria dels casos és necessari realitzar una dilució o dilucions en sèrie per tal de reduir el nombre de cèl·lules esteses. |
Habitualment els [[Cultiu cel·lular|cultius]] tant bacterians com fúngics contenen moltes cèl·lules viables, és a dir, que cada objecte d’estudi té una càrrega microbiana associada. A vegades aquesta càrrega implica tantes cèl·lules viables que no ens permetrien distingir-les en una placa de cultiu, és per això que en la majoria dels casos és necessari realitzar una dilució o dilucions en sèrie per tal de reduir el nombre de cèl·lules esteses. |
||
Aquests recomptes es duen a terme a partir de plaques cultivades en un seguit de paràmetres òptims en funció d’allò que tractem de fer créixer, aquestes són [[Placa de Petri|plaques de Petri]] que contenen [[Medi de cultiu|medis de cultius]] no selectius, normalment [[ |
Aquests recomptes es duen a terme a partir de plaques cultivades en un seguit de paràmetres òptims en funció d’allò que tractem de fer créixer, aquestes són [[Placa de Petri|plaques de Petri]] que contenen [[Medi de cultiu|medis de cultius]] no selectius, normalment [[:es:Agar_nutritivo|agar nutritiu]]). Amb aquesta sembra es pretén aconseguir el màxim de microorganismes presents, de manera que és incubat a una [[temperatura]] concreta i, passat el temps necessari que pot variar d'hores fins a dies, s’observa aquest creixement, que podrà ser significatiu o no, en forma de colònies. Però el recompte no ens permetrà saber si aquestes s’han format a partir d’una sola cèl·lula o diverses, normalment se suposa que cada colònia prové d'una única cèl·lula de les presents a la part que se sembra de la mostra inicial, per tant, el nombre total de colònies presents a la placa de Petri després de la incubació correspon a les cèl·lules presents a la mostra. |
||
Així doncs, definirem les UFC com el nombre mínim de cèl·lules separables sobre la superfície o bé dins d’un agar semisòlid que donaran lloc al desenvolupament d’una colònia visible a l’ull humà de l’ordre de milions de cèl·lules descendents. Aquestes podran ser pars, cadenes o raïms i fins i tot cèl·lules individuals.<ref>{{Ref-web|títol=Unidad_formadora_de_colonias|url=https://www.quimica.es/enciclopedia/Unidad_formadora_de_colonias.html|consulta=2022-11-15}}</ref> |
Així doncs, definirem les UFC com el nombre mínim de cèl·lules separables sobre la superfície o bé dins d’un agar semisòlid que donaran lloc al desenvolupament d’una colònia visible a l’ull humà de l’ordre de milions de cèl·lules descendents. Aquestes podran ser pars, cadenes o raïms i fins i tot cèl·lules individuals.<ref>{{Ref-web|títol=Unidad_formadora_de_colonias|url=https://www.quimica.es/enciclopedia/Unidad_formadora_de_colonias.html|consulta=2022-11-15}}</ref> |
||
| Línia 16: | Línia 16: | ||
Però tal com hem comentat, aquest tipus de mètode de recompte és indirecte i no és exacte, de manera que podrem estar subestimant la quantitat total de UFC a causa de diversos motius; com ara que algunes cèl·lules s’hagin separat en el moment d’homogeneïtzar, o que els paràmetres escollits en fer la sembra no hagin estat els adequats i no hagin permès que totes les cèl·lules s’hi poguessin desenvolupar. |
Però tal com hem comentat, aquest tipus de mètode de recompte és indirecte i no és exacte, de manera que podrem estar subestimant la quantitat total de UFC a causa de diversos motius; com ara que algunes cèl·lules s’hagin separat en el moment d’homogeneïtzar, o que els paràmetres escollits en fer la sembra no hagin estat els adequats i no hagin permès que totes les cèl·lules s’hi poguessin desenvolupar. |
||
Per resoldre aquests problemes, hi ha altres mètodes de mesura com ho són la [[citometria de flux]], la qual no necessita una fase de [[Proliferació cel·lular|proliferació]] cel·lular tot i que encra presenta el problema de l’homogeneïtzació, o la [[PCR en temps real]], que quantifica el nombre de còpies d’un marcador [[ADN|d’ADN]] específic. |
Per resoldre aquests problemes, hi ha altres mètodes de mesura com ho són la [[citometria de flux]], la qual no necessita una fase de [[Proliferació cel·lular|proliferació]] cel·lular tot i que encra presenta el problema de l’homogeneïtzació, o la [[PCR en temps real]], que quantifica el nombre de còpies d’un marcador [[ADN|d’ADN]] específic. |
||
=== |
=== Diferència entre UFC i cèl·lula bacteriana === |
||
En microbiologia, una colònia és una agrupació de bacteris, fongs o altres microorganismes, que tenen la capacitat de créixer en un medi de cultiu, generant una massa, observable a simple vista o no, de morfologies i característiques determinades.<ref>{{Ref-web|títol=What is a "Colony" in Microbiology?|url=https://hudsonrobotics.com/what-is-a-colony-in-microbiology/|consulta=2022-11-16|llengua=en-US}}</ref> |
|||
El creixement d'aquests microorgansimes com a colònies depèn de molts factors que no són reproduibles a l'hora de realizar sembres en plaques, per això existeixen diversos models predictius de creixement que tracten d'explicar com aquest es donaria en cultius planctònics. <ref>{{Ref-publicació|article=Bacterial Colonies in Solid Media and Foods: A Review on Their Growth and Interactions with the Micro-Environment|url=https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2015.01284|publicació=Frontiers in Microbiology|data=2015|issn=1664-302X|pmc=PMC4664638|pmid=26648910|volum=6|doi=10.3389/fmicb.2015.01284|nom=Sophie|cognom=Jeanson|nom2=Juliane|cognom2=Floury|nom3=Valérie|cognom3=Gagnaire|nom4=Sylvie|cognom4=Lortal|nom5=Anne|cognom5=Thierry}}</ref> |
|||
Tant a nivell macroscòpic com microscòpic podem observar diferències entre colònies. La teoria ens indica que una sola cèl·lula bacteriana pot esdevenir una colònia sencera per mitjà de fissions binaries, però a vegades ens podem trobar davant situacions en les que, fent una comparativa amb mètodes directe de recompte, els resultats de les cèl·lules bacterianes totals presents és diferent als obtinguts per tècniques indirectes. Això és degut a que alguns microorganismes, durant aquests processos de separació, no ho acaben de dur a terme completament, de manera que romanen unides i afecten al nombre total final de cèl·lules individuals generant aquestes diferències amb els mètodes directes.<ref name=":7" /> |
|||
| ⚫ | |||
Les UFC tenen un ús principal d'eina de recompte, i aquestes són emprades dins de molts àmbits en la ciència. |
Les UFC tenen un ús principal d'eina de recompte, i aquestes són emprades dins de molts àmbits en la ciència. |
||
| Línia 27: | Línia 34: | ||
L'obtenció d'aquest nombre total de microorganismes presents en un determinat ambient/cultiu és necessari per establir diversos paràmetres en molts camps tant d'alimentació com ara de control d'aigües, ja que la presència o absència de microorganismes en indrets concrets ens permetran determinar la qualitat d'aquests. En el cas de l'aigua, aquestes mesures s'apliquen no únicament a la potable de consum, on s'accepta un màxim de 100 ufc/100 ml, sinó també a l'aigua de refrigeració, on els paràmetres són més elevats acceptant fins a 10.000 ufc/100 ml.<ref>{{Ref-web|títol=UFC - Unidad Formadora de Colonias en un Líquido|url=https://www.merus.es/ufc-unidad-formadora-colonias/|consulta=2022-11-15|llengua=es}}</ref> En els aliments dependrà de quin estem estudiant, però també del microorganisme present. |
L'obtenció d'aquest nombre total de microorganismes presents en un determinat ambient/cultiu és necessari per establir diversos paràmetres en molts camps tant d'alimentació com ara de control d'aigües, ja que la presència o absència de microorganismes en indrets concrets ens permetran determinar la qualitat d'aquests. En el cas de l'aigua, aquestes mesures s'apliquen no únicament a la potable de consum, on s'accepta un màxim de 100 ufc/100 ml, sinó també a l'aigua de refrigeració, on els paràmetres són més elevats acceptant fins a 10.000 ufc/100 ml.<ref>{{Ref-web|títol=UFC - Unidad Formadora de Colonias en un Líquido|url=https://www.merus.es/ufc-unidad-formadora-colonias/|consulta=2022-11-15|llengua=es}}</ref> En els aliments dependrà de quin estem estudiant, però també del microorganisme present. |
||
| ⚫ | |||
== Unitat formadora de plaques == |
== Unitat formadora de plaques == |
||
== Probiòtics == |
|||
== Sembra de microorganismes == |
== Sembra de microorganismes == |
||
=== Dilucions === |
=== Dilucions === |
||
Revisió del 19:20, 16 nov 2022
| Tipus | unitat de mesura  |
|---|---|
| Sistema d'unitats | microbiologia |
La unitat formadora de colònies o UFC (o a vegades també CFU de l’anglès Colony-forming unit), són un tipus d'unitat de mesura indirecta emprada per tal de realitzar una quantificació de microorganismes en mostres tant sòlides com líquides, i que poden ser d’origen natural o mostres de laboratori. És a dir, les UFC tracten d’estimar el nombre de cèl·lules bacterianes o fúngiques viables que hi ha en la nostra mostra. Aquesta mesura generalment expressa la relació a una unitat de volum (sovint expressada en mil·lilitres), tot i que també podem trobar expressada amb una relació de massa, en el cas que ens trobem en una mostra sòlida.
Les concentracions de les UFC es poden expressar mitjançant la notació logarítmica en base 10.
UFC / mL = (Nº de colònies * Factor de dilució) / mL sembrats en placa
Generalitats
El terme viables fa referència a l’habilitat de les nostres cèl·lules de multiplicar-se per fissió binària en condicions controlades, a diferència d’altres mètodes de recompte com ara la microscòpia òptica on es consideren tant cèl·lules viables com no.[1][2]
Habitualment els cultius tant bacterians com fúngics contenen moltes cèl·lules viables, és a dir, que cada objecte d’estudi té una càrrega microbiana associada. A vegades aquesta càrrega implica tantes cèl·lules viables que no ens permetrien distingir-les en una placa de cultiu, és per això que en la majoria dels casos és necessari realitzar una dilució o dilucions en sèrie per tal de reduir el nombre de cèl·lules esteses.
Aquests recomptes es duen a terme a partir de plaques cultivades en un seguit de paràmetres òptims en funció d’allò que tractem de fer créixer, aquestes són plaques de Petri que contenen medis de cultius no selectius, normalment agar nutritiu). Amb aquesta sembra es pretén aconseguir el màxim de microorganismes presents, de manera que és incubat a una temperatura concreta i, passat el temps necessari que pot variar d'hores fins a dies, s’observa aquest creixement, que podrà ser significatiu o no, en forma de colònies. Però el recompte no ens permetrà saber si aquestes s’han format a partir d’una sola cèl·lula o diverses, normalment se suposa que cada colònia prové d'una única cèl·lula de les presents a la part que se sembra de la mostra inicial, per tant, el nombre total de colònies presents a la placa de Petri després de la incubació correspon a les cèl·lules presents a la mostra.
Així doncs, definirem les UFC com el nombre mínim de cèl·lules separables sobre la superfície o bé dins d’un agar semisòlid que donaran lloc al desenvolupament d’una colònia visible a l’ull humà de l’ordre de milions de cèl·lules descendents. Aquestes podran ser pars, cadenes o raïms i fins i tot cèl·lules individuals.[3]
Però tal com hem comentat, aquest tipus de mètode de recompte és indirecte i no és exacte, de manera que podrem estar subestimant la quantitat total de UFC a causa de diversos motius; com ara que algunes cèl·lules s’hagin separat en el moment d’homogeneïtzar, o que els paràmetres escollits en fer la sembra no hagin estat els adequats i no hagin permès que totes les cèl·lules s’hi poguessin desenvolupar.
Per resoldre aquests problemes, hi ha altres mètodes de mesura com ho són la citometria de flux, la qual no necessita una fase de proliferació cel·lular tot i que encra presenta el problema de l’homogeneïtzació, o la PCR en temps real, que quantifica el nombre de còpies d’un marcador d’ADN específic.
Diferència entre UFC i cèl·lula bacteriana
En microbiologia, una colònia és una agrupació de bacteris, fongs o altres microorganismes, que tenen la capacitat de créixer en un medi de cultiu, generant una massa, observable a simple vista o no, de morfologies i característiques determinades.[4]
El creixement d'aquests microorgansimes com a colònies depèn de molts factors que no són reproduibles a l'hora de realizar sembres en plaques, per això existeixen diversos models predictius de creixement que tracten d'explicar com aquest es donaria en cultius planctònics. [5]
Tant a nivell macroscòpic com microscòpic podem observar diferències entre colònies. La teoria ens indica que una sola cèl·lula bacteriana pot esdevenir una colònia sencera per mitjà de fissions binaries, però a vegades ens podem trobar davant situacions en les que, fent una comparativa amb mètodes directe de recompte, els resultats de les cèl·lules bacterianes totals presents és diferent als obtinguts per tècniques indirectes. Això és degut a que alguns microorganismes, durant aquests processos de separació, no ho acaben de dur a terme completament, de manera que romanen unides i afecten al nombre total final de cèl·lules individuals generant aquestes diferències amb els mètodes directes.[2]
Usos de les UFC
Les UFC tenen un ús principal d'eina de recompte, i aquestes són emprades dins de molts àmbits en la ciència.
En el cas de la microbiologia clínica, utilitzar les UFC és una part essencial del diagnòstic d'una malaltia infecciosa, ja que és necessari conèixer la quantitat de microorgansimes presents per poder fer un bon estudi de la relació hoste-patogen i establir un bon tractament, ja que en funció d'aquest nombre es podrà saber si el microorganisme en qüestió desenvoluparà un paper beneficiós o perjudicial. Aquest nombre variarà en funció del microorgansime.[6]
Aquesta quantificació també és fonamental en estudis d'ecologia microbiana per tal d'esbrinar més sobre el comportament dels microorganismes d'estudi així com els ambients on es desenvolupen i la quantitat exacta que es troba colonitzant aquest.[6]
L'obtenció d'aquest nombre total de microorganismes presents en un determinat ambient/cultiu és necessari per establir diversos paràmetres en molts camps tant d'alimentació com ara de control d'aigües, ja que la presència o absència de microorganismes en indrets concrets ens permetran determinar la qualitat d'aquests. En el cas de l'aigua, aquestes mesures s'apliquen no únicament a la potable de consum, on s'accepta un màxim de 100 ufc/100 ml, sinó també a l'aigua de refrigeració, on els paràmetres són més elevats acceptant fins a 10.000 ufc/100 ml.[7] En els aliments dependrà de quin estem estudiant, però també del microorganisme present.
Unitat formadora de plaques
Sembra de microorganismes
Dilucions
En condicions adients de creixement, els bacteris es multipliquen i donen lloc a poblacions tan grans que sovint esdevé un problema a l'hora de visualitzar-les o contar-les correctament. Per això, es necesari diluir-les i obtenir colònies aïllades capaces de ser comptades.
Una dilució en sèrie (dilució seriada o banc de dilucions) és una seqüència de dilucions en què es redueix la concentració progressivament. Normalment, el factor de dilució és el mateix a cada pas, per la qual cosa les concentracions de la sèrie conformen una progressió geomètrica.[8]
Dilució = Volum de mostra / Volum total (Mostra + diluent)
Una vegada s'han realitzat les dilucions es procedeix a sembrar 0,1 mL de mostra de cada tub en una placa diferent. Les plaques s'incuben durant 24h a 37Cº aproximadament (fins que les colònies són apreciables pel seu recompte).[9]
Els resultats s'expressen en unitats formadores de colònies per mil·lilitre (CFU/mL)
Sembra homogènia
S'agafa un volum de 0,1 mL de cultiu líquid amb la micropipeta i es diposita a la superficie del medi de la placa. Immediatament després, s'estén per tota la placa amb la nansa de Digralsky fent una lleugera pressió.
Sembra en escoces
Mètodes de recompte
El recompte del nombre de microorganismes d'una mostra pot calcular-se de diverses maneres, pero sempre s'haurà de tenir present que, només se li donarà valor i es podran tenir en compte aquelles plaques on hagin crescut un nombre determinat de colònies on els paràmetres canviaran depenent del laboratori.[10] Normalment es considera adequat utilitzar entre 15 i 150 colònies, pero a vegades el rang ascendeix fins les 300.[11][12] Si hi ha poques colònies en una placa es considerarà un resultat atzarós i si se'n conten moltes, ho haurà més probabilitat que hi hagi solapament de diverses UFC en una sola colònia.[13]
El recompte d'UFC és un mètode de recompte directa de cèl·lules viables juntament amb NMP[14] o espectrofotometria, però hi han altres tècniques com la citometria de flux,[15] càmeres de recompte (Neubauer i Thoma) i el microscopi que permeten fer un recompte directe de cèl·lules totals.[16] En tots dos casos, el recompte es realitza tenint en compte la presencia de cèl·lules microbianes en la mostra. Per altre banda, també es possible fer un recompte microbià amb mètodes indirectes on es detecta la presencia de microorganismes mitjançant la concentració o abundància d'un component celular concret (ATP, ARN, LPS o proteïnes).[12][17]
Recompte en placa o directe
El mètode més tradicional i que ha dia d'avui segueixen utilitzant molts laboratoris consisteix en pintar o marcar amb un retolador cada una de les colònies que es localitzin en la placa mentre es van contant.[12] A vegades, per fer-ho menys feixuc, es pot utilitzar un comptador de colònies de camp fosc. Aquest porta incorporat una llum adequada, una placa de vidre quadriculada, una lent amplificadora, un pulsador i una pantalla digital on s'enregistren el nombre de cops que es pulsa el contador que seria equivalent al nombre de colònies que s'observen. Està dissenyat per al comptatge ràpid i precís de les colònies de bacteris i floridura en plaques de cultiu. Per altre banda, també es podria utilitzar un registrador mecànic o electrònic: Combina la funció de comptador electrònic per pressió, amb el marcatge mitjançant un marcador indeleble, impedint un doble comptatge.[18]
Recompte en superfície
El recompte en placa per sembra en superficie consisteix en sembrar un volum conegut de la dissolució, normalment 0,1 mL, sobre el cultiu de la placa de Petri. Mitjançant aquest mètode, les colònies o CFU creixen sobre la superficie del medi i es poden compta mitjançant mètodes tradicionals ja que, s'observen bé.[10] S'ha d'assumir que cada colònia es desenvolupa a partir d'una única cèl·lula viable.[12] Generalment, s'utilitza aquest procés pel recompte de bacterias aeròbies.[19]
Formula: N = C * D * 10
Recompte en massa o profunditat
El recompte en placa per sembra en profunditat consisteix en afegir al medi de cultiu fos 1 mL de dissolució de microorganismes i sembrar-ho posteriorment a una placa de Petri. Quan l'agar es refreda, s'incuba la placa i les colònies es desenvolupen tant a l'interior de l'agar com a la superficie.[12] Generalment, s'utilitza aquest procés pel recompte de bacterias anaerobis facultatius o microaeròfils.[19]
Formula: N = C * D * 1
Recompte per filtració
El recompte per filtració en placa consisteix en filtrar la dissolució o medi on es troben les cèl·lules d'interès per tal de concertar-les retingudes en una membrana o filtre. A continuació s'incuba la membrana amb el medi adequat perquè els microorganismes puguin desenvolupar-se i s'incuba pel seu posterior recompte.[12][20] És útil per quan la càrrega microbiana es baixa i per tant, si s'utilitzessin els mètodes anteriors possiblement no es trobaria el suficient creixement.[12]
Eines per comptar colònies
Com s'ha d'escrit en l'apartat anterior, tradicionalment el recompte de colònies s'ha realitzat amb l'ajuda d'un bolígraf o rotulador. Aquesta tasca pot resultar molt laboriosa i pesada, portant a invertir-hi més temps del que caldria. És per això, que amb el avenç de les noves tecnologies, s'han anat desenvolupant sistemes alternatius que substitueixen aquest recompte tradicional per altres de més productius.
Software per comptar CFUs
Permet realitzar un recompte a partir de fotografies de plaques mitjançant diferents eines. Això suposa una reducció del temps de recompte, ja que és molt més ràpid realitzar una fotografia que no pas comptar una a una cada colònia.
Algunes de les eines més utilitzades són:
- NIST's Integrated Colony Enumerator (NICE) està dissenyat per comptar colònies fosques de múltiples regions d'interès en una placa d'agar.[21]
- Image J, com a tret distintiu respecte la resta de softwares de recompte, permet realitzar diferents recomptes d'una mateixa placa. És a dir, suma el nombre de colònies noves al recompte realitzat prèviament.[22]
- Open CFU és d'ús gratuït i permet realitzar recomptes des de l'ordinador personal. A més es tracta d'un programa molt robust, precís i ràpid. [23]
- Cell Profiler té la capacitat d'identificar i mesurar una gran varietat d'elements biològics a partir d'imatges. Pot ser útil en altres processos com: recompte i classificació de llevats, quantificació de cèl·lules tumorals de ratolí, assajos de respostes a ferides... A més de realitzar recompte, pot mesurar un gran espectre de variables com la seva localització en la imatge, intensitat de color, textura, mida, nombre de cèl·lules o colònies veïnes.[24]
Aquests només són alguns exemples dels programes més utilitzats per el recompte colònies, però n'hi ha altres, tots tenen el mateix objectiu però utilitzen algoritmes diferents.
Sistemes automatitzats
Al llarg de nombrosos apartats d'aquesta pàgina s'ha recalcat el laboriòs procés que constitueix el recompte manual en placa, a més aquest procés pot portar fàcilment a l'aparició d'errors.[25] Hi ha una tendència a analitzar només dilucions molt grans del cultiu original, ja que aquestes presenten menys colònies per comptar. Aquest anàlisi de dilucions molt grans, pot provocar que errors mínims en el recompte manual generin un biaix signficiatiu en el nombre de colònies presents en el cultiu original.[26]
A més, molts cops només es realitza un recompte de regions concretes de la placa realitzant-se una extrapolació del nombre de colònies de la resta de la placa.[27] Un altre problema present en la majoria de cultius és la presència de colònies sobreposades donant lloc a resultats de recompte erronis.
S'han realitzat nombrosos estudis dirigits a elaborar sistemes automatitzats de recompte de colònies de bacteris, sobretot de microorganismes amb un paper important en la patògenia en humans (Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa...). Un altre dels objectius d'aquests estudis es aconseguir sistemes que siguin fàcils de fer funcionar per part dels tècnics i amb un cost no massa elevat.[26]
Hardware de recompte de colònies
El sistema al complet consta de diferents components. La zona de la base esta constituida per una placa d'alumini amb un suport per retirar i inserir plaques de petri. Aquesta estructura està dissenyada per minimitzar la dispersió de la llum, la qual serà subministrada per una font d'alimentació de llum amb un atenuador. Finalment el sistema consta d'una càmara connectada via USB a un ordinador, serà la que ens permetrà obtenir una imatge de la placa sobre la qual realitzarem el recompte.[28]
Il·luminació
Un component essencial d'aquests sistemes automatitzats és l'elecció del tipus d'iluminació que s'utilitza. Com les colònies, habitualment, estan lleugerament elevades de les superfícies d'agar s'utilitza un tipus d'iluminació que rep el nom de "Blue dark field illumination". Aquest tipus d'il·luminació, a partir d'estudis comparant-la amb altres tipus, s'ha vist que es la que permet la millor discriminació de colònies respecte el medi que l'envolta.[29]
Algoritme de segmentació de colònies
Després de capturar la imatge del conjunt de colònies que formen la placa de cultiu, cal discriminar unes colònies d'altres. Per fer-ho, primerament s'ha de donar un pre-processament mitjançant un filtre que s'anomena "Top-Hat". Aquest filtre és utilitzat per destacar objectes d'interès clars en un fons fosc.[30] Finalment, per poder obtenir el recompte final de colònies, s'utilitza un classificador Bayes. Aquest tipus de classificador, es basa en el teorema de Bayes (com bé indica el seu nom) i es caracteritza per assumir que la presència o absència d'una característica concreta no està relacionada amb la presència o absència del qualsevol altre característica[31]. És essencial realitzar aquest pas, per tal de separar aquelles colònies que es troben sobreposades o molt pròximes entre elles.
Cal tenir en compte que els algoritmes utilitzats en aquests sistemes automatitzats de recompte de colònies són molt complexos i consten de més pasos dels que s'han esmentat en aquesta pàgina. A més dels mencionats, es donen diversos processos d'analisi geomètric, purificació d'imatge i eliminació d'errors.
Mètodes alternatius
S'ha comentat anteriorment que el mètode preferit per l'anàlisi quantitativa de la població de cultius purs i mixtes es basa en la placa de dilucions en sèrie i el recompte posterior d'unitats formadores de colònies. En els darrers anys, una sèrie de mètodes alternatius d'alt rendiment (HT) que es basen en la PCR quantitativa, l'etiquetatge fluorescent o el sondeig del genoma amb microarrays ha guanyat popularitat, però aquests mètodes requereixen de l'ús d'equips especials i un ampli desenvolupament de nous protocols. A més, alguns són poc compatibles amb substrats complexos i mostres ambientals i per això, a dia d'avui es segueix utilitzant el recompte tradicional com la primera eina de recompte.[32]
Recompte de partícules bio-fluorescents (BFPCs)
Es tracta d'una tecnologia innovadora basada en la autoflorescència intrínseca dels microorganismes. S'utilitza un làser (a 450 nm) per excitar molècules biològiques i detectar la fluorescència emesa per la mostra.[33] Aquesta mostra pot ser monitoritzada per uns analitzadors que poden calcular la mida de cada colònia i la intensitat de la seva fluorescència. L'avantatge principal d'aquest mètode respecte les tècniques tradicionals és el fet que no hi ha necessitat de preparar la mostra ni manipular-la. A més aquest sistema té la capacitat de diferenciar entre partícules inertes i elements biològics. [34]
Unitats alternatives
A més a més d' unitats formadores de colònies, també es poden utilitzar els paràmetres:
- Nombre més probable (NMP): Mètode per fer un recompte de cèl·lules viables en concentracions baixes de cèl·lules o quan el recompte mitjançant UFC no es pràctic.[35][36]
- Unitats fishman modificades (UFM): Mètode que té en compte els bacteris viables pero no cultivables a l'hora de dur a terme el recompte.[36]
Aplicació sobre mesures alimentaries
Els protocols d'aplicació a l'industria alimentaria són molt estrictes. Cada microorganisme té unes concentracions màximes a cada aliment. Per exemple, el criteri a aplicar pel què fa als resultats de les anàlisis de detecció de Salmonella, Listeria o altres patògens en superfícies netes i desinfectades ha de ser d'absència.[37]
Entre un recompte de 10^-6 i 10^-7 en aliments, indica alteració i per tant, contaminació.
Perspectives de futur
Referències
- ↑ «Unidades formadoras de colonias - Labster Theory». [Consulta: 15 novembre 2022].
- ↑ 2,0 2,1 «AROUND LAB NEWS / EN » The difference between CFU and a bacterium cell» (en anglès). [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ «Unidad_formadora_de_colonias». [Consulta: 15 novembre 2022].
- ↑ «What is a "Colony" in Microbiology?» (en anglès americà). [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ Jeanson, Sophie; Floury, Juliane; Gagnaire, Valérie; Lortal, Sylvie; Thierry, Anne «Bacterial Colonies in Solid Media and Foods: A Review on Their Growth and Interactions with the Micro-Environment». Frontiers in Microbiology, 6, 2015. DOI: 10.3389/fmicb.2015.01284. ISSN: 1664-302X. PMC: PMC4664638. PMID: 26648910.
- ↑ 6,0 6,1 Jesús, Muñoz-Rojas,; Elizabeth, Morales-García, Yolanda; Antonino, Baez-Rogelio,; Verónica, Quintero-Hernández,; Paulina, Rivera-Urbalejo, América «Métodos económicos para la cuantificación de microorganismos» (en anglès). Zenodo, 15-12-2016. DOI: 10.5281/zenodo.5525235.
- ↑ «UFC - Unidad Formadora de Colonias en un Líquido» (en castellà). [Consulta: 15 novembre 2022].
- ↑ Julio Ricardo Moreno. Virginia Helena Albarracín «Aislamiento, cultivo e identificación de microorganismos ambientales a partir de muestras naturales». Aislamiento, cultivo e identificación de microorganismos ambientales a partir de muestras naturales, 2012, pàg. 1- 15.
- ↑ A. J. Rondón , L. M. Samaniego , R. Bocourt , S. Rodríguez , G. Milián , M. J. Ranilla , M. Laurencio & M. Pérez «Aislamiento, identificación y caracterización parcial de las propiedades probióticas de cepas de Lactobacillus sp. procedentes del tracto gastrointestinal de pollos de ceba». Isolation, identification and partial characterization of the probiotic properties of Lactobacillus sp. strains obtained from the gastrointestinal tract of broilers, 02-10-2009, pàg. 1-9.
- ↑ 10,0 10,1
- ↑ Fernando Trinks «ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS». Análisis microbiológico de los alimentos, Novembre 2014, pàg. 153.
- ↑ 12,0 12,1 12,2 12,3 12,4 12,5 12,6 «Laboratori de Microbiologia» (en català). Universitat de València, 2019-2020. [Consulta: 22 novembre 2015].
- ↑ «Introducció al laboratori microbiològic» (en català). Universitat de Girona, 10-11-2022. [Consulta: 10 novembre 2022].
- ↑ DE MAN, J. C. The probability of most probable numbers. European journal of applied microbiology and biotechnology., 1975, pàg. vol. 1, no 1, p. 67-78.
- ↑ John M. Walker «Methods in Molecular Biology». Animal cell culture, 1989, pàg. 543.
- ↑ «Cell Counting with Neubauer Chamber» (en anglès). Celeromics. [Consulta: 22 novembre 2015].
- ↑ Merja Karwoski «Food Reviews International». Automated direct and indirect methods in food microbiology: A literature review, 03-11-2009, pàg. 1 - 21.
- ↑ Sánchez F., Erika P.; Núñez R, Dámaris; Cruz L., Roberto O.; Torres H., Mayra A.; Herrera M., Elsa V «Simulación y Conteo de Unidades Formadoras de Colonias». Simulación y Conteo de Unidades Formadoras de Colonias, 12-03-2017, pàg. 100 - 101.
- ↑ 19,0 19,1 M W LeChevallier, R J Seidler,T M Evans «Enumeration and characterization of standard plate count bacteria in chlorinated and raw water supplies.». Enumeration and characterization of standard plate count bacteria in chlorinated and raw water supplies., 01-10-1980, pàg. 922–930.
- ↑ Angèlica Maria Jaimes Moreno «Validación interna del método filtración por membrana para la detección y recuento de coliformes totales y Escherichia coli en muestras de aguas residuales, superficiales y subterráneas en medio». VALIDACIÓN INTERNA DEL MÉTODO FILTRACIÓN POR MEMBRANA PARA LA DETECCIÓN Y RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y Escherichia coli EN MUESTRAS DE AGUAS RESIDUALES, SUPERFICIALES Y SUBTERRÁNEAS EN MEDIO COLINSTANT, 2018, pàg. 1-64.
- ↑ «NIST's Integrated Colony Enumerator (NICE)» (en anglès). NIST, 16-09-2009.
- ↑ Sánchez Valenciano, Daniel. «Análisis del software ImageJ para el análisis científico de imágenes», 25-03-2014. [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ Geissmann, Quentin «OpenCFU, a New Free and Open-Source Software to Count Cell Colonies and Other Circular Objects». PLoS ONE, 8, 2, 15-02-2013, pàg. e54072. DOI: 10.1371/journal.pone.0054072. ISSN: 1932-6203. PMC: 3574151. PMID: 23457446.
- ↑ Lamprecht, Michael R.; Sabatini, David M.; Carpenter, Anne E. «CellProfiler™: free, versatile software for automated biological image analysis». BioTechniques, 42, 1, 01-01-2007, pàg. 71–75. DOI: 10.2144/000112257. ISSN: 0736-6205.
- ↑ Albano, Maria S; Rothman, William; Scaradavou, Andromachi; Blass, Devin P; McMannis, John D. «Automated Counting of Colony Forming Units (CFU): Towards Standardization of the Measurement of Potency in Cord Blood Cell Therapy Products» (en anglès). Blood, 118, 21, 18-11-2011, pàg. 485. DOI: 10.1182/blood.V118.21.485.485. ISSN: 0006-4971.
- ↑ 26,0 26,1 Brugger, Silvio D.; Baumberger, Christian; Jost, Marcel; Jenni, Werner; Brugger, Urs «Automated Counting of Bacterial Colony Forming Units on Agar Plates». PLoS ONE, 7, 3, 20-03-2012, pàg. e33695. DOI: 10.1371/journal.pone.0033695. ISSN: 1932-6203. PMC: 3308999. PMID: 22448267.
- ↑ Experts, This web site is designed and hosted by Biznetix-Your Business Internet. «http://microbiologynetwork.com/counting-colonies.asp» (en anglès). [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ Shrestha, Ashma. «Colony Counters: Types, Principles and Uses» (en anglès americà). [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ «Bright and dark-field illumination». [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ «Top Hat and Black Hat Transform using Python-OpenCV» (en anglès americà), 04-06-2020. [Consulta: 15 novembre 2022].
- ↑ Src='https://Secure.gravatar.com/Avatar/4762eecb770dec2b885e537b15750e25?s=24, <img Alt=; #038;d=mm; Srcset='https://Secure.gravatar.com/Avatar/4762eecb770dec2b885e537b15750e25?s=48, #038;r=g'. «Clasificador Naive Bayes | JacobSoft» (en espanyol de Mèxic), 15-12-2018. [Consulta: 15 novembre 2022].
- ↑ Sieuwerts, S.; de Bok, F.A.M.; Mols, E.; de Vos, W.M.; van Hylckama Vlieg, J.E.T. «A simple and fast method for determining colony forming units» (en anglès). Letters in Applied Microbiology, 47, 4, 2008-10, pàg. 275–278. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2008.02417.x.
- ↑ «Rapid Microbiological Methods & Alternatives To Colony Forming Units: A Pathway To Implementation?». [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ Saturday; October 1; 2022. «Advanced Environmental Monitoring and Troubleshooting with Bio-Fluorescent Particle Counters: Four Case Studies from the Process and Environmental Monitoring Methods Working Group» (en anglès). [Consulta: 16 novembre 2022].
- ↑ William G. Cochran «Most Probable Number». Estimation of Bacterial Densities by Means of the "Most Probable Number", June. 1950, pàg. Vol. 6, No. 2, 105-116.
- ↑ 36,0 36,1 Hisashi Satoh, Yutaka Katayose and Reiko Hirano «Simple enumeration of Escherichia coli concentrations in river water samples by measuring β-D-glucuronidase activities in a microplate reader.». Simple enumeration of Escherichia coli concentrations in river water samples by measuring β-D-glucuronidase activities in a microplate reader., 2021, pàg. 8.
- ↑ «MANUAL DE SEGURETAT ALIMENTÀRIA DEL SECTOR CARNI PORCÍ: COM GESTIONAR ELS PRINCIPALS PERILLS» (en català). Innovacc, 2013. [Consulta: 22 novembre 2015].