ELISA

Microplaca ELISA

ELISA (de l'anglès, Enzyme Linked Immunosorbent Assay) és una tècnica bioquímica que es basa en la detecció d'un antigen immobilitzat sobre una fase sòlida mitjançant anticossos que directa o indirectament produeixen una reacció, el producte de la qual pot ser mesurat amb un espectrofotòmetre. L'element clau de totes les ELISAs és la utilització dels anticossos. Aquestes proteïnes són produïdes per animals en resposta a una estimulació per part d'un antigen i és aquesta propietat la que s'aprofita per poder dur a terme la tècnica al laboratori.

Tècnica

La tècnica ELISA té moltes de les propietats d'un immunoassaig ideal, proporcionant una sèrie d'avantatges:

Senzillesa

• Addició dels reactius en petites quantitats.
• Separació de la part unida i de la part lliure de reactius amb un senzill procediment de rentat.
• Fàcil adsorció de proteïnes en el plàstic fase sòlida).

Lectura

• El producte resultant acolorit pot ser observat a simple vista de manera que pot determinar-se si la tècnica ha funcionat.
• Es poden examinar els resultats estadísticament ja que es poden quantificar amb l'espectrofotòmetre.

Rapidesa

• Tècnica reproduïble en unes hores.
• Els resultats es poden llegir ràpidament a l'espectrofotòmetre ( 96 pouets en 5s).

Sensibilitat

• Capacitat de detecció de nivells baixos de 0,01 – 1 µg/mL. Aquests nivells són ideals per a molts dels diagòstics.

Reactius:

• Gran flexibilitat en el mercat de reactius dissenyats específicament per als procediments ELISA.

Adaptabilitat:

• Diferents configuracions de la tècnica permet examinar i resoldre un gran numero de problemes. Aquesta característica resulta de gran utilitat per a la recerca científica.

Cost

• Procediment econòmic.

• Reactius amb un preu baix.

Acceptabilitat

• La tècnica es utilitzada en molts camps de la ciència i està reconeguda con un “gold- Standard” assaig.

Seguretat

• Tant el procediment com els reactius utilitats no suposen un risc per a la salut.

Disponibilitat

• Els assajos ELISA es poden reproduir en qualsevol laboratori.

Kits

• Existeix un ampli i exitós nombre de kits preparats per dur a terme la prova de manera senzilla.

Estandardització

• La quantificació de les dades obtingudes permet estandarditzar els valors.

En resum, l'ELISA és versàtil, robusta, simple de realitzar, utilitza reactius econòmics i aconsegueix, mitjançant l'ús de la fase sòlida, una separació fàcil entre la fracció retinguda i la fracció lliure.

A més a més, s'han proposat i desenvolupat diferents mètodes d'amplificació del senyal (luminescència, cascades enzimàtiques, etc...) que han permès elevar la sensibilitat d'alguns ELISA a l'obtinguda en la RIA (radioimmunoassaig) hormonal.

Aquest mètode ha tingut una aplicació molt gran en aquells camps en què es precisava la quantificació de productes mitjançant anticossos: diagnosi clínica, detecció viral, classificació d'anticossos en isotips, buscar anticossos monoclonals...

El mètode ELISA es por resumir en els següents passos:

1. Adsorció de l'antigen o anticòs en la fase sòlida de plàstic.

2. Adició de la mostra i dels reactius.

3. Incubació dels reactius.

4. Separació dels reactius lligats i lliures amb rentats.

5. Adició de l'enzim de marcatge.

6. Adició del sistema enzimàtic de detecció (desenvolupament del color).

7. Lectura visual o espectrofotomètrica del les mostres.

Hi ha diversos tipus d'ELISA:

• ELISA directe
• ELISA indirecte
• ELISA sandvitx
• ELISA competitiu

ELISA directe

Etapes de l'assaig ELISA directe

L'ELISA directe és el procediment més senzill del ventall de possibilitats que ofereix la tècnica. Permet la detecció i quantificació d'antígens en la mostra problema mitjançant la seva unió a anticossos específics marcats amb un enzim que, al reaccionar amb el seu substrat, modifica el color de la dissolució estudiada. Aquesta variació del color és mesurada amb un espectrofotòmetre i permet la quantificació de la concentració de l'antigen. Les longituds d'ona obtingudes a l'assaig són comparades amb les d'una mostra de concentració coneguda, fet que permet calcular la concentració de l'antigen a la mostra problema.

L'ELISA directe té importants limitacions ja que requereix l'ús d'un anticòs específic per cada antigen problema, per tant, es necessita una gran varietat d'anticossos específics que, en molts cassos, no estan disponibles en el mercat.

La mostra problema, dissolta en un tampó, habitualment de pH elevat, es diposita sobre la fase sòlida de plàstic donant-se l'adsorció de l'antigen durant la incubació. És bàsic que el tampó no contingui proteïnes susceptibles de competir amb l'antigen problema durant l'adsorció. Els antígens no units a la fase sòlida són eliminats mitjançant un rentat que esbandeix els antígens lliures restant una fase sòlida coberta pels antígens problema.

El següent pas consisteix en l'adició d'anticossos específics de l'antigen problema marcats per un enzim i la incubació de les mostres. Els anticossos marcats estaran dissolts en un tampó de bloqueig que evitarà la unió passiva dels anticossos a la fase sòlida, no obstant, permetrà la formació d'unions antigen-anticòs marcats. Tot seguit es procedeix a un nou rentat que eliminarà els anticossos marcats que no hagin format la unió.

S'afegeix el substrat o cromogen específic que reaccionarà amb l'enzim unit a l'anticòs i generarà una modificació en el color de la mostra.Desprès d'un temps determinat és pararà la reacció, modificant el pH o afegint un reactiu inhibidor i es procedirà a la lectura de la proba utilitzant un espectrofotòmetre.

ELISA indirecte

Etapes de l'assaig ELISA indirecte

L'ELISA indirecte és un procediment molt semblant a l'ELISA directe. La diferència principal amb l'ELISA directe, el qual detecta l'antígen d'una mostra problema, és que permet la identificació i la quantificació d'anticossos en un sèrum problema.

Per realitzar un ELISA indirecte primerament s'incuba l'antigen, el qual s'adhereix a la fase sòlida. S'afegeixen anticossos i s'incuben amb la fase sòlida que conté l'antigen. Els anticossos específics per al antigen s'hi uniran. Es realitza un rentat en el que s'elimina tot allò que no sigui l'anticòs que es vol detectar.

A continuació s'afegeixen anticossos marcats amb un enzim, els quals van dirigits contra els anticossos originals de l'espècie que els ha produït(antianticòs), per tant, s'uniran als anticossos afegits a l'inici del procediment i es repeteix un segon rentat. Llavors es fa reaccionar l'enzim amb el seu substrat i es produeix un canvi de color.

Finalment s'atura el procés de coloració desprès d'un període d'incubació i es calcula el canvi de color en l'espectrofotòmetre.

L'ELISA indirecte és molt utilitzat en serologia i és molt útil per detectar anticossos sèrics contra el virus de la immunodeficiència humana(VIH), agent causant de la malaltia del síndrome de la immunodeficiència adquirida(SIDA).

ELISA sandvitx

L'ELISA de tipus sandvitx mesura la quantitat d'antigen entre dues capes d'anticossos. Els antígens a mesurar han de contenir, com a mínim, dos llocs antigènics capaços d'unir-se a l'anticòs.

Els assajos d'aquest tipus estan limitats a la quantificació d'antígens multivalents com ara proteïnes o polisacàrids. L'ELISA sandvitx per a la quantificació d'antígens és especialment valuosa quan la concentració d'antígens és baixa i /o estan continguts en altes concentracions de proteïna contaminant.

L'ELISA sandvitx es pot dividir en dos sistemes: el directe i l'indirecte.

ELISA sandvitx directe

Etapes de l'assaig ELISA sandvitx directe

L'ELISA de tipus sandvitx directe implica la unió passiva d'anticossos a la fase sòlida. Aquests anticossos (anticossos de captura) s'uneixen posteriorment als antígens que s'afegeixen. L'antigen(s) es dilueixen en un tampó de bloqueig per evitar la unió no específica a la fase sòlida. Els components del tampó de bloqueig no han de contenir antígens que puguin unir-se als anticossos de captura. Després de la incubació i el rentat, el complex anticòs-antigen està unit a la fase sòlida.

L'antigen capturat es detecta mitjançant l'addició i incubació d'anticossos marcats amb enzims específics en tampó de bloqueig. Per tant, aquest és un enllaç conjugat directe amb les dianes antigèniques de l'antigen capturat. Aquest segon anticòs pot ser el mateix que l'utilitzat per a la captura, o ser diferent.

Després de la incubació i rentat, l'enzim unit es desenvolupa mitjançant l'addició de substrat/cromogen, s'atura la reacció i, finalment, es llegeix utilitzant un espectrofotòmetre. Com que s'utilitza un sol enzim-anticòs conjugat, el sistema es limita a les especificitats i propietats inherents a aquest conjunt particular d'anticòs. Això limita la versatilitat de la prova, per exemple, cada preparació d'anticòs utilitzat ha de ser etiquetat (per diferents antígens) de la mateixa manera com l'ELISA directe es limita a preparacions d'anticossos individuals. El sistema també està limitat a que els antígens tinguin com a mínim dos llocs antigènics (epítops) ja que, tant la captura com la detecció d'anticossos, s'hi uneixen. Això pot limitar l'assaig de complexos antigènics relativament grans.

L'anticòs de captura (en la fase sòlida), i l'anticòs de detecció, poden ser contra diferents epítops en un complex d'antigen. Això pot ser útil en relació a les molècules antigèniques ja que hi ha una major probabilitat de que els anticossos de detecció s'uneixin. També pot ser un avantatge quan s'investiguen les petites diferències entre els preparats antigènics per l'ús de diferents anticossos i la detecció d'un anticòs de captura comú.

L'ús dels mateixos anticossos per la captura i la detecció (per exemple, mAbs) pot conduir a problemes degut a la severa limitació de llocs d'unió disponibles per al detector. La mida i la relació espaial (topografia) dels epítops a la diana antigènica també és crític i pot afectar considerablement l'assaig.

ELISA sandvitx indirecte

Les etapes són bastant similars a les de l'ELISA sandvitx directe. Així, els anticossos són passivament units a la fase sòlida i l'antigen(s) són capturats. En aquest cas, els anticossos de detecció afegits no estan etiquetats amb enzim. Després de la incubació i rentat, els anticossos de detecció són en sí mateixos detectats mitjançant l'addició i la incubació amb un enzim conjugat antiespècie. El conjugat unit es processa com es descriu en els altres sistemes.

L'avantatge d'aquest assaig és que es pot afegir qualsevol nombre d'anticossos, procedents de diferents fonts, a l'antigen capturat, sempre que l'espècie en què es produeix no sigui la mateixa que l'anticòs de captura. És possible utilitzar la mateixa espècie d'anticòs si les tècniques immunoquímiques s'utilitzen per seleccionar i produir formes particulars d'anticossos i posant atenció a l'especificitat del conjugat d'enzim utilitzat.

ELISA competitiu

Etapes de l'assaig ELISA competitiu

L'objectiu de l'ELISA competitiu és determinar la concentració d'antigen (Ag) o anticòs (Ac). Per determinar la concentració d'antigen (Figura) que trobem a una mostra, es cobrirà la superfície del pou amb un anticòs específic.

Posteriorment, s'omplirà el pou amb dos antígens diferents: l'antigen que es troba dins de la mostra (en cas d'haver-n'hi) i un antigen marcat amb un enzim per la unió amb l'anticòs de captura.

Es durà a terme una neteja del pou per tal d'eliminar aquells antígens que no s'hagin unit als anticossos. Si a la nostra mostra hi ha gran quantitat d'antígens, aquests s'uniran als anticossos i els antígens marcats seran eliminats a la neteja; en cas contrari, si tenim pocs o cap antigen a la mostra, els antígens marcats seran els que s'uniran als anticossos i per tant, seran els que romandran al pou. D'aquí ve el nom d'ELISA competitiu, ja que els dos tipus d'antígens fan una competició per unir-se als anticossos.

A continuació, s'aplicarà el substrat i el cromogen per tant d'obtenir la coloració que ens determinarà la concentració de l'antigen. La coloració que obtindrem serà inversament proporcional a la concentració d'Ag ja que una coloració intensa ens indica que els antígens que han quedat units als anticossos són els Ag marcats i que, per tant, a la mostra no hi havia o n'hi havia pocs. Els valors de concentració es calculen a partir d'una corba patró construïda amb concentracions conegudes d'Ag.

Per determinar la concentració d'anticòs, es fa seguint el mateix mètode però en comptes de cobrir el pou amb anticossos específics, el cobrim amb antígens específics i el pou s'omplirà amb anticossos de la mostra i anticossos marcats. Aquest tipus d'ELISA no és molt utilitzat ja que surt poc rentable tenir anticossos específics marcats per a cada antigen.

Bibliografia

• John R. Crowther. The ELISA Guidebook. Agència Internacional de l'Energia Atòmica, Viena, Àustria (anglès)
• Carlos Gamazo, Ignacio Lopez-Goñi, Ramón Díaz. Manual práctico de MICROBIOLOGIA. Masson castellà
• Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ., Microbiología de Prescott, Harley y Klein. 2009, 7a Ed. McGraw-Hill-Interamericana, S.A.U. 2009. (castellà)