ELISA

De Viquipèdia
Dreceres ràpides: navegació, cerca
Per a altres significats vegeu «Elisa».
Microplaca ELISA

ELISA (de l'anglès, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) és una tècnica bioquímica que es basa en l'ús d'antígens o anticossos marcats amb un enzim, de manera que els conjugats resultants tinguin activitat tant immunològica com enzimàtica. És necessari que un dels components (antigen o anticòs) estigui marcat amb un enzim i insolubilitzat sobre un suport (immunoabsorbent) per tal que la reacció antigen-anticòs quedi immobilitzada i d'aquesta manera pugui ser mesurada fàcilment mitjançant l'addició d'un substrat específic que, en interaccionar amb l'enzim, produirà un color visible a simple vista i quantificable mitjançant l'ús d'un espectrofotòmetre o un colorímetre.

En aquest assaig d'immunoabsorció associat a un enzim, es pot detectar menys d'un nanogram (10-9 g) d'una proteïna.

Història[modifica | modifica el codi]

L'ELISA és un assaig que va ser desenvolupat pel grup de recerca de Peter Perlmann i Eva Engvall a la Universitat d'Estocolm a Suècia. A Països Baixos, de manera independent però simultània, el grup d'Anton Schuurs i Bauke van Weemer va crear l'EIA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Aquests dos mètodes van ser inventats a la dècada de 1960 però el seu desenvolupament i ús va arribar durant les dues dècades següents.

Tot i que les tècniques EIA i ELISA diferien en el disseny de l'assaig, els dos mètodes estaven basats en el principi de l'immunoassaig amb un enzim en lloc de radioactivitat, com ho feia el radioimmunoassaig (RIA). En aquesta tècnica, descrita per primera vegada l'any 1960 per Solomon Berson i Rosalyn Yalow a Nova York, la radioactivitat produïa un senyal que indicava si en la mostra hi havia present un antigen o anticòs específic.

L'ELISA va sorgir com una alternativa més segura, sobretot per la salut del personal del laboratori i pels residus creats, i econòmica al radioimmunoassaig. La idea d'aquest nou procediment era de poder usar marcadors enzimàtics, molècules grans i voluminoses, i que no interferissin la reacció antigen-anticòs. Va ser rebuda amb molt escepticisme però els resultats dels primers experiments foren encoratjadors.

Entre 1966 i 1969, un grup a Villejuif, França, liderat per Stratis Avrameas va exposar els seus resultats favorables d'acoblament antigen-anticòs amb enzims com la fosfatasa alcalina o la glucosa oxidasa, entre altres. Volien usar els antígens i anticossos units a enzims per detectar anticossos o antígens per immunofluorescència i aplicar aquestes noves eines en histopatologia. G.B. Pierce, a Los Angeles, juntament amb altres investigadors, va seguir aquesta línia d'investigació, mentre que L. Wide d'Uppsala, Suècia, va desenvolupar una tècnica de (radio)immunoabsorció en la qual els anticossos eren insolubilitzats mitjançant el seu acoblament a cel·lulosa o perles de Sephadex, un gel dextrà.

L'any 1971, Engvall i Perlmann van publicar un experiment en el qual mesuraren la quantitat d'immunoglobulina G de sèrum de conill amb fosfatasa alcalina com a marcador. Aquest mateix any, van Weemen i Schuurs van publicar el seu treball sobre EIA i demostraren que era possible quantificar concentracions de gonadotropina coriònica en orina usant l'enzim peroxidasa de rave picant.

En la comercialització de "kits" d'EIA i ELISA es van aplicar tècniques de fase sòlida per al desenvolupament de plaques de microtitulació (96 cel·les) en les que un antigen o bé un anticòs estaven unides no covalentment amb el suport de fase sòlida. La comercialització d'aquestes plaques va comportar a la vegada uns avenços en la fabricació de pipetes automatitzades o lectors de paques, entre d'altres. Els test EIA i ELISA, dels quals van aparèixer ràpidament variants, no foren del tot reeixits fins que, entre el final de la dècada de 1970 i l'inici de la de 1980, van aconseguir tenir l'alta sensibilitat del radioimmunoassaig.

Aquest immunoassaig han suposat un gran avenç científic en molts camps. En l'àmbit clínic, per exemple, ja als anys setanta i vuitanta van permetre la detecció de partícules víriques com les que ocasionen l'hepatits B, d'anticossos del virus de la immunodeficiència humana, d'anticossos de toxoplasma i rubella, etc.

Principis (fonaments bàsics)[modifica | modifica el codi]

La prova de l'ELISA es basa en una reacció d'antigen-anticòs, un dels dos de reactivitat coneguda. Els antígens o anticossos de la mostra s'immobilitzen sobre un suport sòlid. Posteriorment s'afegeix un anticòs o antigen específic addicional sobre la superfície i es produeix la interacció antigen-anticòs. Aquest anticòs o antigen addicional està unit a un enzim o per si sol pot ser detectat per un anticòs secundari vinculat a un enzim a través de bioconjugació. En l'etapa final, s'afegeix una substància que conté el substrat de l'enzim. Això donarà lloc a una reacció amb un senyal detectable, com per exemple un canvi de color.

En el moment que afegim l'enzim, és necessari que passi un cert temps. Si aquest no és suficient perquè es produeixi la reacció, no s'apreciarà cap color, per tant, el resultat interpretat serà erroni, donarà lloc a un fals negatiu i farà que disminueixi la sensibilitat de la tècnica.

Per altra banda, la temperatura també influenciarà en l'aparició de falsos negatius. Si la temperatura d'incubació és molt baixa, no es completarà el complex antigen-anticòs. D'altra banda, si és molt alta, les proteïnes (antigen i anticòs) es desnaturalitzaran i per tant, disminuirà la seva capacitat per interaccionar, donant també falsos negatius.

Però també ens podem trobar amb falsos positius com quan s'utilitza molt antigen o anticòs. Si en canvi n'utilitzem massa poc, donarà un fals negatiu.

Tècnica de l'ELISA[modifica | modifica el codi]

ELISA(ms)

El mètode ELISA és por resumir en les següents passes:

  • Adsorció de l'antigen o anticòs en la fase sòlida de plàstic
  • Addició de la mostra i dels reactius
  • Incubació dels reactius
  • Separació dels reactius lligats i lliures amb rentats
  • Addició de l'enzim de marcatge
  • Addició del sistema enzimàtic de detecció (desenvolupament del color)
  • Lectura visual o espectrofotomètrica de les mostres
1. Fase sòlida

La fase sòlida més utilitzada és la gradeta de 96 cel·les feta de clorur de polivinil (plaques flexibles) i de poliestirè (plaques rígides i inflexibles). Els fabricants proveeixen diferents varietats de plaques, és impossible recomanar una única d'aquestes varietats com la varietat universalment acceptada per l'ELISA. És prudent utilitzar la placa recomanada per cada assaig específic però és possible realitzar el mateix test utilitzant diferents varietats de plaques mantenint l'estandardització adequada. De manera ideal, en cas d'utilitzar un mètode d'espectrometria per llegir els resultats és recomanable una gradeta amb unitats de fons pla i en cas que la lectura la fem visualment (a ull) utilitzaríem gradetes de fons rodó.

Una característica clau de la fase sòlida en l'ELISA és que els antígens o els anticossos poden estar enganxats a la superfície de manera fàcil per adsorció passiva. Aquest procés és l'anomenat revestiment de la placa. La majoria de proteïnes s'absorbeixen a superfícies de plàstic, probablement com a resultat d'interaccions hidrofòbiques entre les estructures no polars de la proteïna i el plàstic.

2. Rentat

El propòsit del rentat és el de separar els reactius units i no units (lliures). Això implica el buidatge de totes les unitats de la gradeta seguit de l'addició de líquid dins les unitats. Aquest procés s'ha de repetir almenys 3 cops. El líquid utilitzat per rentar està habitualment tamponat, normalment amb PBS (0.1M, pH 7.4), per mantenir la isotonicitat, ja que la majoria de reaccions antigen-anticòs són òptimes sota tals condicions.

3. Addició dels reactius

Els immunoassajos impliquen l'administració precisa dels reactius en relatius petits volums. Els volums habitualment utilitzats en l'ELISA es troben en el rang de 50 o 100µm per cel·les de la placa. És important que l'operador de l'assaig conegui i tingui una bona pràctica a l'hora de pipetejar.

4. Incubació

La reacció entre antigen i anticòs depèn de la seva proximitat. Durant l'ELISA això es veu afectat per les seves respectives concentracions, distribució, temps i temperatura d'incubació i pH (tampó). En cada una de les interaccions cal tenir en compte l'afinitat de l'anticòs amb l'antigen. Trobem dos tipus de condicions en la incubació: incubació de plaques rotant(amb sacsejada) i incubació amb plaques estacionàries. Això també afectarà el temps i la temperatura per realitzar una ELISA amb èxit.

5. Conjugació amb Enzims

La sensibilitat analítica de l'ELISA depèn de l'habilitat de l'anticòs d'unir i de l'activitat específica d'enzim del reactiu immunològic marcats, el conjugat. El substrat es tria generalment per produir un producte acolorit. La taxa de desenvolupament del color serà proporcional, durant un determinat interval, de la quantitat d'enzim conjugat present i de la concentració de producte de la catàlisis del substrat.

6. Reaccions de parada

Alguns reactius s'afegeixen per prevenir més reaccions enzimàtiques en l'ELISA. Això es fa en el moment adequat per cada tipus d'assaig. El reactiu utilitzat en aquest procés d'aturada s'anomena reactiu de parada. Aquest procés se sol realitzar en el moment on la relació entre enzim, substrat i producte es troba en la fase lineal. Concentracions molars d'àcids forts o bases fortes aturen l'activitat enzimàtica per desnaturalització dels enzims.

7. Lectura

Finalment com el producte de la catàlisi del substrat està acolorit pot ser llegit de dues maneres: de forma visual (d'ull) o utilitzant un espectrofotòmetre.

Aplicacions[modifica | modifica el codi]

  • Diagnòstic d'infeccions per microorganismes: aquesta tècnica és un assaig immunoenzimàtic molt utilitzat en l'àrea mèdica per quantificar molècules, especialment aquelles que acostumen a experimentar canvis davant infeccions causades per bacteris, virus, fongs o paràsits. El diagnòstic es realitza detectant la presència d'antigens de l'agent infecciós. L'ELISA ser la primera prova de detecció àmpliament utilitzada pel VIH (Virus de la Immunodeficiència Humana) a causa de la seva alta sensibilitat. D'altra banda, en la clínica de petits animals, l'ELISA més utilitzat es permet la detecció d'anticossos FIV (Virus de la Immunodeficiència Felina). És també un assaig molt usat en els diagnòstics in vitro en laboratoris mèdics. Permet la detecció d'anticossos de Mycobacterium tuberculosis, de rotavirus en les femtes, de marcadors de l'hepatitis B en sèrums, d'entertoxines de Escherichia coli en les femtes entre d'altres. A més a més de permetre el diagnòstig de malalties infeccioses permet detectar-ne d'altres com algunes d'autoimmunitàries.
  • Comprovació de l'efectivitat de medicaments: és una tècnica usada en assajos de nous medicaments per comprovar l'efectivitat dels seus efectes quantificant les molècules d'interès.
  • Quantificació de metabòlits: el format d'aquesta prova és particularment apropiat per processar un gran nombre de mostres i també per dur a terme títols d'anticossos. A més permet mesurar hormones com la progesterona, estrògens, cortisol, insulina, testosterona, gonadotropina coriònica humana, TSH, etc.
  • Aplicacions en la indústria alimentaria: s'utilitza per a la detecció de possibles al·lèrgens en aliments, com la llet, cacauets, nous, ametlles i ous.

Avantatges i inconvenients[modifica | modifica el codi]

La tècnica ELISA té moltes de les propietats d'un immunoassaig ideal, proporcionant una sèrie d'avantatges:

  • Senzillesa: s'observa en molts aspectes de la tècnica com per exemple en l'addició dels reactius en petites quantitats i la senzilla separació dels reactius lliures que no han quedat units amb un simple rentat, entre d'altres.
  • Lectura: el producte que en resulta té color i pot ser observat a simple vista per comprovar que la tècnica hagi funcionat. A més a més, els resultats es poden examinar fàcilment i de manera exacta i objectiva amb un espectrofotòmetre o colorímetre.
  • Rapidesa: és una prova reproduïble en poques hores i els resultats són llegits ràpidament amb un sol aparell.
  • Sensibilitat: l'ELISA és capaç de detectar concentracions molt petites (d'entre 0,01 i 1µg/mL) de la molècula que es vol estudiar, característica ideal per als diagnòstics.
  • Reactius: en el mercat, se'n pot trobar una gran diversitat i específics per als procediments ELISA.
  • Adaptabilitat: se n'han desenvolupat diferents models per a utilitzar en més situacions diferents.
  • Cost: el procediment i els reactius són força econòmics.
  • Acceptabilitat: és utilitzada en molts caps de la ciència i molt reconeguda.
  • Seguretat: tant el procediment com els reactius utilitzats no suposen cap risc per la salut.
  • Disponibilitat: és un procediment reproduïble en qualsevol laboratori.
  • Equips: existeix una àmplia varietat d'equips o "kits" ja preparats per a dur a terme la prova de manera encara més senzilla.
  • Estandardització: la quantificació de les dades obtingudes permet l'estandardització dels valors.

En resum, l'ELISA és una prova versàtil, robusta, simple de realitzar, amb reactius econòmics i, aconsegueix mitjançant l'ús de la fase sòlida una separació fàcil entre la fracció retinguda i la fracció lliure.

A més a més, s'han proposat i desenvolupat diferents mètodes d'amplificació del senyal (luminescència, cascades enzimàtiques, etc.) que han permès incrementar la sensibilitat d'alguns ELISA respecte a l'obtinguda en la RIA (radioimmunoassaig) hormonal.

No obstant això, també presenta algun inconvenient. Per exemple, la facilitat de les immunoglobulines sèriques per adherir-se al plàstic de les microplaques pot ser causant de falsos positius.

Tipus[modifica | modifica el codi]

Hi ha diversos tipus d'ELISA:

  • directe: quantifica antígens coneguts
  • indirecte: busca i quantifica anticossos per antígens coneguts
  • sandvitx: busca i quantifica antígens
  • competitiu: quantifica antígens o anticossos

ELISA directe[modifica | modifica el codi]

Etapes de l'assaig ELISA directe

L'ELISA directe és el procediment més senzill del ventall de possibilitats que ofereix la tècnica. Permet la detecció i quantificació d'antígens en la mostra problema mitjançant la seva unió a anticossos específics marcats amb un enzim que, en reaccionar amb el seu substrat, modifica el color de la dissolució estudiada. Aquesta variació del color és mesurada amb un espectrofotòmetre i permet la quantificació de la concentració de l'antigen. Les longituds d'ona obtingudes a l'assaig són comparades amb les d'una mostra de concentració coneguda, fet que permet calcular la concentració de l'antigen a la mostra problema.

L'ELISA directe té importants limitacions, ja que requereix l'ús d'un anticòs específic per cada antigen problema, per tant, es necessita una gran varietat d'anticossos específics que, en molts casos, no estan disponibles en el mercat.

La mostra problema, dissolta en un tampó, habitualment de pH elevat, es diposita sobre la fase sòlida de plàstic donant-se l'adsorció de l'antigen durant la incubació. És bàsic que el tampó no contingui proteïnes susceptibles de competir amb l'antigen problema durant l'adsorció. Els antígens no units a la fase sòlida són eliminats mitjançant un rentat que esbandeix els antígens lliures restant una fase sòlida coberta pels antígens problema.

El següent pas consisteix en l'addició d'anticossos específics de l'antigen problema marcats per un enzim i la incubació de les mostres. Els anticossos marcats estaran dissolts en un tampó de bloqueig que evitarà la unió passiva dels anticossos a la fase sòlida, no obstant això, permetrà la formació d'unions antigen-anticòs marcats. Tot seguit es procedeix a un nou rentat que eliminarà els anticossos marcats que no hagin format la unió.

S'afegeix el substrat o cromogen específic que reaccionarà amb l'enzim unit a l'anticòs i generarà una modificació en el color de la mostra. Després d'un temps determinat es pararà la reacció, modificant el pH o afegint un reactiu inhibidor i es procedirà a la lectura de la prova utilitzant un espectrofotòmetre.

ELISA indirecte[modifica | modifica el codi]

Etapes de l'assaig ELISA indirecte

L'ELISA indirecte és un procediment molt semblant a l'ELISA directe. La diferència principal amb l'ELISA directe, el qual detecta l'antígen d'una mostra problema, és que permet la identificació i la quantificació d'anticossos en un sèrum problema.

Per realitzar un ELISA indirecte primerament s'incuba l'antigen, el qual s'adhereix a la fase sòlida. S'afegeixen anticossos i s'incuben amb la fase sòlida que conté l'antigen. Els anticossos específics per a l'antigen s'hi uniran. Es realitza un rentat en què s'elimina tot allò que no sigui l'anticòs que es vol detectar.

A continuació s'afegeixen anticossos marcats amb un enzim, els quals van dirigits contra els anticossos originals de l'espècie que els ha produït (antianticòs), per tant, s'uniran als anticossos afegits a l'inici del procediment i es repeteix un segon rentat. Llavors es fa reaccionar l'enzim amb el seu substrat i es produeix un canvi de color.

Finalment s'atura el procés de coloració després d'un període d'incubació i es calcula el canvi de color en l'espectrofotòmetre.

L'ELISA indirecte és molt utilitzat en serologia i és molt útil per detectar anticossos sèrics contra el virus de la immunodeficiència humana (VIH), agent causant de la malaltia de la síndrome de la immunodeficiència adquirida (SIDA).

ELISA sandvitx[modifica | modifica el codi]

Article principal: ELISA sandvitx

L'ELISA de tipus sandvitx mesura la quantitat d'antigen entre dues capes d'anticossos. Els antígens a mesurar han de contenir, com a mínim, dos llocs antigènics capaços d'unir-se a l'anticòs.

Els assajos d'aquest tipus estan limitats a la quantificació d'antígens multivalents com ara proteïnes o polisacàrids. L'ELISA sandvitx per a la quantificació d'antígens és especialment valuosa quan la concentració d'antígens és baixa i /o estan continguts en altes concentracions de proteïna contaminant.

L'ELISA sandvitx es pot dividir en dos sistemes: el directe i l'indirecte.

ELISA sandvitx directe[modifica | modifica el codi]

Etapes de l'assaig ELISA sandvitx directe

L'ELISA de tipus sandvitx directe implica la unió passiva d'anticossos a la fase sòlida. Aquests anticossos (anticossos de captura) s'uneixen posteriorment als antígens que s'afegeixen. L'antigen(s) es dilueixen en un tampó de bloqueig per evitar la unió no específica a la fase sòlida. Els components del tampó de bloqueig no han de contenir antígens que puguin unir-se als anticossos de captura. Després de la incubació i el rentat, el complex anticòs-antigen està unit a la fase sòlida.

L'antigen capturat es detecta mitjançant l'addició i incubació d'anticossos marcats amb enzims específics en tampó de bloqueig. Per tant, aquest és un enllaç conjugat directe amb les dianes antigèniques de l'antigen capturat. Aquest segon anticòs pot ser el mateix que l'utilitzat per a la captura, o ser diferent.

Després de la incubació i rentat, l'enzim unit es desenvolupa mitjançant l'addició de substrat/cromogen, s'atura la reacció i, finalment, es llegeix utilitzant un espectrofotòmetre. Com que s'utilitza un sol enzim-anticòs conjugat, el sistema es limita a les especificitats i propietats inherents a aquest conjunt particular d'anticòs. Això limita la versatilitat de la prova, per exemple, cada preparació d'anticòs utilitzat ha de ser etiquetat (per diferents antígens) de la mateixa manera com l'ELISA directe es limita a preparacions d'anticossos individuals. El sistema també està limitat a què els antígens tinguin com a mínim dos llocs antigènics (epítops) , ja que, tant la captura com la detecció d'anticossos, s'hi uneixen. Això pot limitar l'assaig de complexos antigènics relativament grans.

L'anticòs de captura (en la fase sòlida), i l'anticòs de detecció, poden ser contra diferents epítops en un complex d'antigen. Això pot ser útil en relació a les molècules antigèniques, ja que hi ha una major probabilitat que els anticossos de detecció s'uneixin. També pot ser un avantatge quan s'investiguen les petites diferències entre els preparats antigènics per l'ús de diferents anticossos i la detecció d'un anticòs de captura comú.

L'ús dels mateixos anticossos per la captura i la detecció (per exemple, mAbs) pot conduir a problemes a causa de la severa limitació de llocs d'unió disponibles per al detector. La mida i la relació espaial (topografia) dels epítops a la diana antigènica també és crític i pot afectar considerablement l'assaig.

ELISA sandvitx indirecte[modifica | modifica el codi]

Les etapes són bastant similars a les de l'ELISA sandvitx directe. Així, els anticossos són passivament units a la fase sòlida i l'antigen(s) són capturats. En aquest cas, els anticossos de detecció afegits no estan etiquetats amb enzim. Després de la incubació i rentat, els anticossos de detecció són en si mateixos detectats mitjançant l'addició i la incubació amb un enzim conjugat antiespècie. El conjugat unit es processa com es descriu en els altres sistemes.

L'avantatge d'aquest assaig és que es pot afegir qualsevol nombre d'anticossos, procedents de diferents fonts, a l'antigen capturat, sempre que l'espècie en què es produeix no sigui la mateixa que l'anticòs de captura. És possible utilitzar la mateixa espècie d'anticòs si les tècniques immunoquímiques s'utilitzen per seleccionar i produir formes particulars d'anticossos i posant atenció a l'especificitat del conjugat d'enzim utilitzat.

ELISPOT[modifica | modifica el codi]

Article principal: ELISPOT

El nom és Enzyme-linked Immunosorbent Spot, i aquest acrònim prové del resultat, ja que s'observen unes taques colorides (spot vol dir punt o taca en anglès).

És una prova que deriva de la tècnica ELISA sandvitx i, per tant, tot utilitzar els mateixos principis immunoquímics,presenta difrències: l'ELISA mesura la concentració real de l'antigen, mentre que l'ELISPOT mesura les cèl·lules que estan secretant els productes. Llavors, l'ELISPOT és una combinació d'un immunoassaig i d'un bioassaig, ja que s'utilitzen cèl·lules vives per l'assaig.

Els productes secretats d'interès són citoquines, prostaglandines, hormones i altres, que es produeixen com a resposta immune front un antigen específic. A partir d'aquests es quantificaran les cèl·lules.

ELISA competitiu[modifica | modifica el codi]

Article principal: ELISA competitiu

L'objectiu de l'ELISA competitiu és determinar la concentració d'antigen (Ag) o anticòs (Ac). Per determinar la concentració d'antigen (figura) que trobem a una mostra, es cobrirà la superfície del pou amb un anticòs específic.

Etapes de l'assaig ELISA competitiu

Posteriorment, s'omplirà el pou amb dos antígens diferents: l'antigen que es troba dins de la mostra (en cas d'haver-n'hi) i un antigen marcat amb un enzim per la unió amb l'anticòs de captura.

Es durà a terme una neteja del pou per tal d'eliminar aquells antígens que no s'hagin unit als anticossos. Si a la nostra mostra hi ha gran quantitat d'antígens, aquests s'uniran als anticossos i els antígens marcats seran eliminats a la neteja; en cas contrari, si tenim pocs o cap antigen a la mostra, els antígens marcats seran els que s'uniran als anticossos i per tant, seran els que romandran al pou. D'aquí ve el nom d'ELISA competitiu, ja que els dos tipus d'antígens fan una competició per unir-se als anticossos.

A continuació, s'aplicarà el substrat i el cromogen per tant d'obtenir la coloració que ens determinarà la concentració de l'antigen. La coloració que obtindrem serà inversament proporcional a la concentració d'Ag, ja que una coloració intensa ens indica que els antígens que han quedat units als anticossos són els Ag marcats i que, per tant, a la mostra no hi havia o n'hi havia pocs. Els valors de concentració es calculen a partir d'una corba patró construïda amb concentracions conegudes d'Ag.

Per determinar la concentració d'anticòs, es fa seguint el mateix mètode però en comptes de cobrir el pou amb anticossos específics, el cobrim amb antígens específics i el pou s'omplirà amb anticossos de la mostra i anticossos marcats. Aquest tipus d'ELISA no és molt utilitzat, ja que surt poc rentable tenir anticossos específics marcats per a cada antigen.

Dot - ELISA[modifica | modifica el codi]

El Dot-ELISA o Dot-Blot és una tècnica utilitzada en biologia molecular que permet detectar biomolècules i detectar, analitzar i identificar diferents tipus de proteïnes, en concret antígens del tipus soluble o en suspensió.

Dot-Elisa

És una tècnica molt semblant a la Transferència Western, tot i que més senzilla. La diferència principal entre les dues tècniques és que en la Transferència Western les biomolècules que es volen detectar passen inicialment per un procés d'electroforesi per tal de ser separades segons el seu grau d'electronegativitat, procediment que no es duu a terme en el cas de realitzar un Dot-ELISA. La solució que conté els antígens a detectar s'aplica directament sobre una membrana de nitrocel·lulosa, on després s'afegirà un anticòs conegut específic per tal que es dugui a terme de forma correcta la reacció antigen-anticòs. Finalment s'agrega un anticòs marcat a la mostra que interaccionarà amb la unió antigen-anticòs

El Dot-ELISA permet estalviar temps respecte de la tècnica de Transferència Western, ja que els passos de cromatografia o electroforesi en gel queden omesos, i tampoc es necessiten processos tècnics complicats de transferència del gel a la membrana de nitrocel·lulosa. A més, disminueixen les probabilitats que la prova doni falsos positius, ja que l'anticòs marcat s'uneix únicament a la interacció Ag-Ac i no a l'anticòs o a l'antigen, de manera que mai donarà com a positiu un anticòs lliure.

Tot i això, no dóna informació sobre la mida de la biomolècula, i si n'hi ha dues amb mides diferents, aparaixerà un sol punt. La tècnica Dot-ELISA només ens permetrà confirmar la presència o absència de les biomolècules que estem investigant.

Bibliografia[modifica | modifica el codi]

  • John R. Crowther. The ELISA Guidebook. Agència Internacional de l'Energia Atòmica, Viena, Àustria.
  • Carlos Gamazo, Ignacio Lopez-Goñi, Ramón Díaz. Manual práctico de MICROBIOLOGIA. Masson.
  • Willey JM, Sherwood LM, Woolverton CJ., Microbiología de Prescott, Harley y Klein. 2009, 7a Ed. McGraw-Hill-Interamericana, S.A.U. 2009.
  • Rudolf M. Lequin. Enzyme Immunoassay (EIA) / Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Clinical Chemistry 51, No. 12, 2005.
  • Óscar Rojas-Espinosa. Inmunología (de memoria). Ed. Médica Panamericana, 2006.
  • Alexander E. Kalyuzhny. Handbook of ELISPOT: methods and protocols. Springer, 2005.
  • Gemma Giner. Immunologia; Laboratori de diagnòstic clínic: GFGS. Editat a la Universitat de Barcelona, 2004.
  • Elizabeth Gúzman-Vàzquez. V. Las Pruebas de Elisa.Gac Méd Méx Vol. 140, Suplemento No. 3, 2004.
  • Cultek. Soluciones ELISA, Protocolo y Técnicas.
  • Julio Coll Morales. Técnicas de diagnóstico en virologia. Díaz de Santos.