Adjuvant

De Viquipèdia
Dreceres ràpides: navegació, cerca

Un adjuvant (del llatí: ad: cap a; i juvare: ajuda) és qualsevol substància que s'afegeix a la vacuna per potenciar/dirigir la resposta immunològica enfront d'un antigen. Habitualment, a més d'actuar com a estimulants immunitaris directes, presenten altres accions que indirectament també reforcen la resposta. Acostumen a ser compostos complexes i heterogenis.[1][2]

La co-administració d'adjuvants, que són components immunoestimulants, facilita una bona inducció de la resposta immunològica (veieu sistema immunitari). La seva acció consisteix en iniciar, amplificar i guiar la resposta per aconseguir que sigui de suficient intensitat i durada. A més de potenciar la resposta immunològica, els adjuvants també permeten reduir la quantitat d'antigen o dosis administrats. Els adjuvants són essencials si es desitja establir una memòria a llarg termini del sistema immunològic.[3]

Existeixen diferents tipus d'adjuvants i en general es desconeixen bastant els mecanismes subjacents de llur activitat. A més a més, la combinació d'antigen i adjuvant influeix en la resposta local i sistèmica de l'organisme enfront de la vacuna.

Les vacunes poden ser atenuades o inactivades. La vacuna atenuada es caracteritza per ser menys virulenta, però té més risc de reversió. Per altra banda, la vacuna inactivada està constituïda per microorganismes que no es repliquen o components d'aquests. Donat que la inactivada és més segura, acostuma a ser preferible, però la immunitat que ofereix normalment és insuficient per provocar una resposta adequada. És per aquest motiu que s'utilitzen adjuvants.[2]

Història[modifica | modifica el codi]

La història científica dels adjuvants com a components de les vacunes és curta, tenint el seu inici el 1925:

  • Gaston Ramón (1925): Aquest immunòleg francès va descobrir que les vacunes que s'administraven en situacions més contaminades produïen abscessos en el punt d'inoculació en els cavalls als quals se'ls aplicava,i que els cavalls amb aquests abscessos produïen més anticossos que els vacunats en estricta asèpsia.
  • Gleny i col. (1926): Aquests científics van descobrir els efectes potenciadors que tenen associades les sals d'alumini a les vacunes, i les van denominar genéricament com "adjuvants d'alum"
  • Freund (1936): Va desenvolupar un dels adjuvants més potents i que porta el seu nom. Està compost per una mescla d'agiua i olis juntament amb micro-bacteris.

Més tard, aquest adjuvant va ser modificat per Stuart-Harris (1969), que va eliminar els microbacteris per a disminuir la seva gran toxicitat, creant d'aquesta manera l'anomenat adjuvant incomplet de Freund.

  • Greenberg i Fleming (1947): van demostrar que el toxoide diftèric augmenta l'antigenicitat de la vacuna de la tos ferina de cèl·lules senceres.
  • Johnson i col. (1956): Varen descobrir l'efecte adjuvant dels liposacàrids (LPS) dels bacteris gram negatius, fet que va obrir les portes a diferents tècniques per destoxificar LPS i poder afegir-lo a vacunes.

[4]

Classificació[modifica | modifica el codi]

Els adjuvants es poden classificar en funció de diferents criteris, dentre els quals destaquem la naturalesa de la substància i el mecanisme d'acció.

Respecte a la seva naturalesa, la classificació més general va ser plantejada per Vanselón fa la següent distinció:

  • Substàncies biològiques i derivats, com els micobacteris de la tuberculosi incorporats a l'adjuvant complet de Freund (FCA), mescles de toxines bacterianes, virus, saponines, vitamines (A i E), lanolina i altres.
  • Productes químicament definits de fongs, bacteris i algues: dipèptid muràmic (MDP), trehalosa dimicolat (TMD), proteïna P40 associada al peptidglicà de la paret bacteriana, lípid A, lipopolisacàrids provinents de bacteris gram negatius, glucans de fongs i polisacàrids d'algues.
  • Productes biològics del sistema immune: citocines (IL-2, INFg).
  • Productes sintètics anàlegs de biològics.
  • Preparacions químiques, com els components d'alumini: Al(OH), Al2(SO4)3, Ca(PO4)2, K2(PO4) i sulfat de dextrà. També es poden utilitzar sals de NaCl tractades magnèticament (CM-95):[5]

La classicació segons el mecanisme d'acció es detalla seguidament.

Mecanismes d'acció[modifica | modifica el codi]

Alguns dels mecanismes d’acció atribuïts als adjuvants són els que es citen a continuació, però és possible que n'existeixin d'altres, fins i tot desconeguts actualment:

Es distingeixen quatre tipus bàsics de mecanisme d'acció:

  1. Adjuvants "depot": l'efecte depot - del francès dépôt, que vol dir dipòsit - és aquell en què la substància inoculada roman durant més temps al lloc d'injecció, retardant la degradació de l'antigen. Així, aquests adjuvants permeten que la resposta innata del sistema immunològic perduri més en el temps, allargant l'efecte més immediat de la vacuna.
  2. Adjuvants potenciadors de la presentació d'antigen: estan compostos per partícules que lliuren l'antigen a les cèl·lules presentadores d'antigen.
  3. Adjuvants immunoestimuladors: contenen molècules que estimulen la producció de citocines i estimulen de manera selectiva la resposta Th1 o Th2 mitjançant l'acció dels Toll-Like Receptors (TLRs).
  4. Adjuvants combinats: mitjançant la combinació d'un adjuvant depot o d'un compost per partícules amb un agent immunoestimulador s'aconsegueix un efecte sinèrgic.

Com a resultat de l'acció dels potenciadors de la presentació d'antigen i dels immunoestimuladors, s'aconsegueix la immunitat cel·lular i un augment de la producció d'anticossos.

A continuació s'explica amb més detall cadascun dels tipus d'adjuvants:

  • Adjuvant "depot" → Retard en l'alliberació de l'antigen: la velocitat d'eliminació de l'antigen, el qual entra a l'organisme quan s'inocula la vacuna, es pot reduir si es mescla amb un adjuvant insoluble i per tant de degradació lenta. Quan s'injecta la vacuna amb adjuvant el cos reacciona fent una inflamació granulomatosa perquè l'adjuvant és difícil de degradar. Aquesta inflamació triga cert temps en resoldre's, de manera que l'estímul antigenic dura més temps i així ofereix la possibilitat de crear una resposta immunològica més llarga que si no hi hagués adjuvant. Alguns exemples d'adjuvants d'aquesta mena són les sals d'alumini i l'adjuvant incomplet de Freund. El segon només es fa servir en animals degut als efectes adversos que comporta, que són principalment irritació i destrucció tissular significants.[3]

Al llarg de molts anys es va pensar que aquest era el principal, si no únic, mecanisme d’acció dels adjuvants vacunals. Actualment se sap que les accions són més complexes i que a més de la persistència física, hi ha fenòmens inflamatoris amb alliberació de citocines i especialment una intervenció més eficaç de les cèl·lules presentadores d’antígen. Una variant del retard de l’alliberació la constitueixen els preparats vacunals d’administració oral que estan inclosos en elements com liposomes o microesferes, els quals permeten una resistència més prolongada dels antígens a l’acció dels sucs gàstrics o intestinals.

  • Potenciador de la presentació d'antigen → Activació i maduració de les cèl·lules presentadores d'antígens: a l’inici de la resposta immunitària intervenen principalment les cèl·lules presentadores d’antigen o APC (de l'anglès Antigen Presenting Cells), cèl·lules dendrítiques i macròfags entre d’altres. Per tal que la resposta sigui més eficaç és necessari que madurin i s’activin. Això passa de forma genèrica quan es facilita la fagocitosi i els antígens passen al citoplasma, i d’alguna manera més dirigida administrant certes citocines i molècules “in situ” (respecte a la cèl·lula). A tall d'exemple, l’antigen dD2 de l'herpesvirus simple 2 en emulsió MF59 passa al citoplasma de les cèl·lules dendrítiques quan és fagocitat. Des d'allà, provoca la maduració de la cèl·lula i en conseqüència, l’activació dels limfòcits (consulteu la presentació d'antigen per més informació). D’altra banda, el Resiquimod (R-848), que és un medicament d'ús tòpic per a tractar les lesions cutànies causades per l'herpesvirus simple, activa les cèl·lules dendrítiques a través d’un augment de citocines com IL-12 o IFNa, la qual cosa es demostra per l’augment d’expressió a la seva superfície cel·lular de CD80, CD83, CD86 i CD40, molècules coestimuladores necessàries per una completa activació dels limfòcits T.
  • Immunoestimuladors
    • Modificació de l'equilibri Th1/Th2: els limfòcits T CD4+ o “helper” es divideixen en dos tipus (Th1/Th2) segons els perfils de citocines que alliberen. En resum, en funció del microambient de citocines, el limfòcit desencadenarà un patró de resposta Th1 o Th2. L'activació de limfòcits que segueixen un patró Th1 comporta la síntesi d'IL-2, IFNg, IL-12, TNF-B i TNF-a, principalment. Aquest ambient de citocines comporta una resposta cel·lular especialment eficaç contra agents infecciosos intracel·lulars, com per exemple virus. Per altra banda, l'activació de limfòcits que segueixenun patró Th2 produeixen IL-3 IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13 principalment. Aquest ambient de citoncines condueix a la síntesi d’anticossos i són més eficaces en la defensa contra microorganismes presents a l’espai extracel·lular, com és el cas de la majoria de bactèries. Els adjuvants d'alumini són un exemple dels que promouen la síntesi d’anticossos. Coneixent l'existència d'aquesta dicotomia de patrons de resposta, s'ha obert múltiples vies d'investigació dirigides a desviar la producció per tal de crear una resposta Th1 o Th2 en funció del que sigui convenient per cada patogen. Una de les vies més avançades és la producció de certes seqüències d’ADN molt petites i repetitives que contenen guanina, denominades oligodesoxinucleòtids CpG (ODN CpG). S’ha comprovat la seva eficàcia per facilitar una resposta Th1, fins i tot reconduint una resposta ja prèviament enfocada cap al patró Th2.
    • Citocines adjuvants: molts d'aquests adjuvants són productes complexes d'origen microbià que sovint tenen patrons moleculars associats a patògens (PAMPs). Conseqüentment, activen les cèl·lules dendrítiques i macròfags a través de receptors tipus toll (TLRs), estimulant així la secreció de citocquines com IL-1 i IL-12. En funció de l'antigen concret, poden facilitar una resposta Th1 o Th2. Una línia d’adjuvants promotors de la resposta Th1 promou la síntesi d'IFNg, IL-2 i amb preferència IL-12. Els resultats experimentals són bons, però en un assaig clínic en humans amb vacuna pneumocòccica i IL-12 es van donar reaccions de febre i malestar massa intenses com per incorporar-les en vacunes profilàctiques. Es busquen alternatives, com utilitzar molècules químiques que estimulen la síntesi endògena d'IL-12 per tal d'evitar la seva administració exògena.[3][6]

Principals tipus d’adjuvants[modifica | modifica el codi]

Adjuvants minerals[modifica | modifica el codi]

Es poden classificar en dues categories: sals d'alumini i fosfat de calci. Són adjuvants més emprats i es poden fer servir tant en animals com en humans.

La seva elaboració es pot fer mitjançant precipitació o adsorció. La precipitació s'aconsegueix mitjançant l'addició d'un compost químic, com per exemple alum de potassi (que normalment és sulfat de potassi), sobre l'antigen. Aquestes vacunes s'anomenen "precipitades amb alum" i el seu principal inconvenient és l'heterogenicitat dels precipitats que formen l'adjuvant, motiu pel qual es va desenvolupar la segona tècnica, anomenada "adsorció amb alumini". Aquesta consisteix en preparar una suspensió col·loïdal d'hidròxid d'alumini o de fosfat d'alumini, que tenen la propietat de poder adsorbir l'antigen. L'avantatge d'aquesta tècnica és que permet fer la vacuna de manera estandaritzada i per tant amb resultats homogenis. Actualment, pràcticament no es fan servir les vacunes precipitades amb alum perquè el seu ús s'ha substituït quasibé completament pel de vacunes d'adsorció amb alumini.

Aquests adjuvants no es dissolen bé al pH del líquid intersticial. Quan s'inocula amb un d'aquests adjuvants, comença un lent procés de solubilització afavorit per la presència d’àcids plasmàtics com l’àcid cítric, l’àcid màlic i l’àcid làctic, entre d'altres. S’ha calculat que al cap d’1 mes un 17% de l’alumini d’un hidròxid d’alumini ja ha passat a circulació sanguínia i un 51% en el cas del fosfat d’alumini. Això posa de manifest el temps que pot arribar a trigar en ser eliminat i, per tant, l'efecte perllongador que pot tenir sobre la vacuna.

Els adjuvants derivats de l'alumini han estat motiu de polèmica durant bastants anys. S'ha posat en dubte la seguretat d'aquests adjuvants davant la sospita que suposadament causen diversos efectes adversos greus que serien motiu suficient com per justificar la retirada d'aquests adjuvants en la formulació de vacunes. Tanmateix, s'ha dut a terme estudis epidemiològics per analitzar aquests suposats efectes i la conclusió és, segons el Comitè Consultiu Global sobre la Seguretat de Vacunes (GACVS) de l'Organització Mundial de la Salut (OMS), que no existeix evidencia que les vacunes amb alumini suposin un risc per a la salut.[7]

El fosfat de calci també es pot fer servir amb la tècnica de precipitació o amb la d'adsorció. S'ha fet servir com a adjuvant de vàries vacunes, com les vacunes contra la diftèria, el tètanus, Bordetella pertussis i la poliomielitis. També s'ha provat com a adjuvant en vacunes experimentals contra el VIH.[2]

Adjuvants tensioactius[modifica | modifica el codi]

D'entre els adjuvants tensioactius destaquen les saponines, que són glicòsids tensioactius gràcies a un nucli molecular hidrofòbic. Poden ser glicòsids esteroideus o triterpenoideus i es troben en plantes salvatges o cultivades, en animals marins primitius i algunes bactèries.[8][9][10] Modulen la resposta immune cel·lular i potencien la producció d’anticossos amb una dosi petita.[8][11] Indueixen una forta resposta T-depenent i T-independent juntament amb activació citotòxica per linfocits T CD8+. Són particularment efectius i útils en la immunitat a les mucoses.[8][12]

Existeixen múltiples exemples de saponines que es fan servir com a adjuvants, d'entre els quals trobem el Quil-A i el ginseng. El Quil-A és una saponina extreta de l'escorça de Quillaja saponaria. Les fraccions purificades d'aquesta, principalment QS-21, s'han estudiat com alternatives a l'alum.[8][13][14][15]

Adjuvants derivats de bacteris[modifica | modifica el codi]

Principalment són molècules de la paret de bacteris gram negatius, com Mycobacterium spp., Corynebacterium parvum., Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, o Salmonella minnesota. Actuen a través de la seva unió a receptors tipus toll de les cèl·lules presentadores d’antigen. Els lipopolisacàrids (LPS), que formen part de la paret cel·lular dels bacteris gram negatius, també s'han fet servir com adjuvants perquè són potents mitògens de limfòcits B i també inductors de la producció d'IFNg pels limfòcits T. Tanmateix, es considera que és massa tòxic per al seu ús clínic.[16]

Emulsions[modifica | modifica el codi]

Són mescles d’aigua en oli (W/O, per l'anglès water-in-oil) o d'oli en aigua (O/W, per l'anglès oil-in-water) com àcids grassos lliures, Montanida, adjuvant 65 i Lipovant. Les emulsions produeixen un dipòsit a la zona d’injecció que reté l’antigen durant força temps, sobretot les W/O. Són adjuvants massa tòxics pel seu ús en humans, doncs provoquen inflamacions, granulomes i fins i tot ulceracions.[16][13]

Liposomes[modifica | modifica el codi]

Els liposomes són esferes sintètiques de membrana lipídica, dins les quals s’inclou l’antigen proteic o liposacàrid y que actuen coma mecanisme de transport de la vacuna i alhora com a adjuvants. Potencien tant la immunitat cel·lular com la humoral enfront d'antígens proteïcs i polisacàrids, i es caracteritzen per contribuir a l'increment de la vida mitjana de l’antigen al sistema circulatori, garantint d'aquesta manera una major exposició d'antigen a les cèl·lules presentadores d'antigen.[16][17][18][19] Aquests adjuvants formen microesferes de polímers, que consisteixen en la unió de l’antigen amb diversos polímers biodegradables. En funció de la proporció d’antigen i de polímer es pot regular la vida mitjana del preparat vacunal.

Citocines com adjuvants[modifica | modifica el codi]

S’ha pensat en associar l'IFNg com a estimulador d’immunitat humoral i cel·lular, o com a factor estimulador de colònies de granulòcits i macròfags (GM-CSF pel seu nom en anglès, Granulocite Macrophage Colony-Stimulating Factor) i com a atraient i activador de cèl·lules presentadores d’antigen. És un tipus d’adjuvant poc utilitzat degut al seu alt cost, a la necessitat d'administrar múltiples dosis, a la seva pròpia antigenicitat com a proteïna heteròloga o a l'excessiva reactivitat - febre elevada i símptomes gripals - que presenten els individus als quals se'ls inocula aquest adjuvant.[20]

Combinació d'adjuvants[modifica | modifica el codi]

Cada vegada es practica més la combinació d’adjuvants, buscant que les seves accions es complementin i siguin encara més efectius. Algunes de les combinacions més populars són:

Adjuvant AS04[modifica | modifica el codi]

Aquests són un dels pocs adjuvants moderns d'ús autoritzat en vacunes profilàctiques destinades a humans. Incorpora dos adjuvants d’activitat complementària: el clàssic hidròxid d’alumini i el monofosforil lipídic A (MPL). El MPL és un lipopolisacàrid obtingut de Salmonella minnesota (mencionada més amunt), que es purifica i destoxifica, però que manté intacta la seva capacitat d’unir-se al toll-like receptor-4 (TLR-4) i per tant d¡activar les cèl·lules presentadores d’antigen. En ser tant activadores d'immunitat innata com d'adquirida, augmenten molt l’efecte de l'adjuvant, sobretot en casos d'infeccions de virus i bacteris intracel·lulars, ja que indueix la resposta Th1. L’associació d'hidròxid d’alumini amb MPL aconsegueix una resposta mediada per anticossos més intensa i prolongada, amb una major producció de limfòcits B de memòria. Fins al moment, l'adjuvant AS04, s’ha utilitzat en una vacuna enfront del virus de l’hepatitis B, sobretot en malalts en hemodiàlisis i en situació d’immunodeficiència. Més recentment també s’ha utilitzat contra el virus del papil·loma humà.[21]

Freund’s Complete Adjuvant (FCA)[modifica | modifica el codi]

Aquest adjuvant és una combinació de Mycobacterium tuberculosis mort i emulsió d’aigua en oli (W/O). El bacil de la tuberculosi conté una molècula anomenada muramil-dipèptid (n-acetilmuamil-L-alanil-D-isoglutamina) que activa macròfags i cèl·lules dendrítiques gràcies al seu domini NOD2 (nucleotidebinding oligomerization domain 2). L’FCA promou la producció d'IgG a partir d'IgM, la qual cosa inhibeix la inducció a la tolerància, afavoreix reaccions retardades d'hipersensibilitat, accelera el rebuig a transplantaments i promou la resistència als tumors. La millor manera per aplicar aquest adjuvant és subcutàniament o per via intradèrmica. També s’utilitza molt en casos en què la dosi d’antigen és relativament petita. De moment, l’ús de FCA no està acceptat en bestiar destinat al consum perquè existeix la possibilitat que, degut a un error, el bacteri de la tuberculosi fos actiu, la qual cosa podria representar un risc de zoonosi. A més, l’ús d’adjuvants oliosos en animals destinats a consum és problemàtic perquè l’oli mineral pot arribar a fer malbé la canal de l'animal.[22]

ISCOMS[modifica | modifica el codi]

Els ICOMS o complexos immunoestimulants són uns dels adjuvants més complexos i elaborats que hi ha actualment. Estan formats per colesterol, fosfolípids, saponines i antígens, els quals conjuntament formen particules dodecahèdriques semblants a virus amb una matriu de saponines Quil-A. Aquest adjuvant és molt efectiu en estimular les cèl·lules presentadores professionals i, al seu torn, la saponina promou que produeixin citocines i molècules coestimuladores. Depenent de l’antigen que porti, estimularà més la resposta Th1 o Th2.[21][6]

Altres[modifica | modifica el codi]

Algunes mescles d’adjuvants que també s’utilitzen són les de sals d’alumini amb algammulin (inulina-g), aprofitant que la inulina és un potent activador natural de la via alternativa del complement. Finalment, també cal remarcar que hi ha algunes citocines amb les quals s'està intentant elaborar combinats, com per exemple la IL-12 que estimula les cèl·lules Th1 i augmenta la producció d'IFNg, però tot i així l'ús de citocines encara no està completament estudiat.[5][6]

Referències[modifica | modifica el codi]

  1. Roitt, Ivan. Inmunologia Fundamentos. 10ªedició. Editorial Panamericana, 2003. 
  2. 2,0 2,1 2,2 Virgil, E.J.C. et al. Immunopotentiators in Modern Vaccines. Elsiever Ltd., 2006. 
  3. 3,0 3,1 3,2 Tizard, Ian r. Veterinary Immunology, an Introduction.. 8th ed. Saunders Elsevier, 2009, p. [265-268]. 
  4. Vogel FR, Hem Sl. Immunologic Adjuvants. En Vaccines. Plotkin and Orenstein eds. 4th edition. Elsevier Inc. Filadelfia. 2004
  5. 5,0 5,1 Martínez Manrique, Clara Esther. «Modulación de la respuesta inmune. Tendencias vigentes» (en castellà). MEDISAN, 2005. [Consulta: 10-01-2013].
  6. 6,0 6,1 6,2 Kwissa M, Katsuri SP, Pulendran B. The science of adjuvants. Expert Rev Vaccines 2007
  7. http://www.who.int/vaccine_safety/committee/topics/aluminium/statement_112002/en/index.html
  8. 8,0 8,1 8,2 8,3 Rajput, Song-hua, Chen-wen i Arijo. «Adjuvant effects of saponins on animal immune response». J Zhejiang Univ Sci B, 8, 3, Març 2007, pàg. 153-161. DOI: 10.1631/jzus.2007.B0153. PMID: PMC1810383 [Consulta: 17/01/2014].
  9. Riguera, R. «Isolating bioactive compounds from marine organisms». J Marine Biotechnology, 5, 1997, pàg. 187-193.
  10. Yoshiki, Kudou, Okubo. «Relationship between chemical structures and biological activities of triterpenoid saponins from soybean (review)». Biosci Biotechnol Biochem, a Pubmed, 62, 12, 1998, pàg. 2291–2299. DOI: 10.1271/bbb.62.2291.
  11. Oda, Matsuda, Murakami, Katayama, Ohgitani i Yoshikawa. «Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and food plants». Biol Chem, a Pubmed, 381, 1, 2000, pàg. 67-74. DOI: doi: 10.1515/BC.2000.009.
  12. Kensil, CR. «Saponins as vaccine adjuvants». Crit Rev Drug Ther Drug Carrier Syst, a Pubmed, 13, 1-2, 1996, pàg. 1-55.
  13. 13,0 13,1 Allison i Bryars. «Immunological adjuvants: desirable properties and side-effects». Mol Immunol, a Pubmed, 28, 3, 1991, pàg. 279-284. DOI: doi: 10.1016/0161-5890(91)90074-T.
  14. Kensil et al. «Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja-saponaria molina cortex». J Immunology, a Pubmed, 146, 2, 1991, pàg. 431-437.
  15. Takahashi et al. «Induction of cytotoxic CD8+ cells by immunization with purified HIV-1 envelope protein in ISCOMs». Nature, a Pubmed, 146, 2, 1990, pàg. 873-875.
  16. 16,0 16,1 16,2 Nitcheu i Serra. «Outlining novel cellular adjuvant products for therapeutic vaccines against cancer». Expert Rev Vaccines, 10, 8, 2011, pàg. 1207-1220. DOI: doi: 10.1016/0161-5890(91)90074-T [Consulta: 17/01/14].
  17. Shek, Yung i Stanacev. «Comparison between multilamellar and unilamellar liposomes in enhancing antibody formation». Immunology, 49, 1, 1983, pàg. 37-44.
  18. Van Rooijen i Van Nieuwmegen. «Use of liposomes as biodegradable and harmless adjuvants». Methods Enzymol, 93, 1983, pàg. 83-95.
  19. Kramp, Six i Kasel. «Postimmunization clearance of liposome entrapped adenovirus type 5 hexon». Proc Soc Exp Biol Med, 169, 1, 1982, pàg. 135-139.
  20. Ayuvantes Vacunales, Alfredo Blanco Quiros i Rosari Cambronero Martinez, Colarsfe Abril 2011 [Pàg 71-72]
  21. 21,0 21,1 Ayuvantes Vacunales, Alfredo Blanco Quiros i Rosari Cambronero Martinez, Colarsfe Abril 2011 [Pàg 71-72]
  22. Veterinary immunology an introduction, Ian R. Tizard, Editorial Elsevier, 8ª edició 2009. [Pàg 265-268]